Pınar Obakan Yerlikaya

Son dönemde, Amerikan Ulusal Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Enstitüsü direktörü ve immunolog Dr. Anthony Fauci'nin de bulunduğu bir grup bilim insanı, çift maskenin özellikle yeni varyantların da bulaşmasını engellemek için önemli olduğunu belirtti. 

Çift maske ile virüs geçirgenliğini azaltılmasının mümkün olduğunu belirten Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü Öğretim Üyesi Doç. Dr. Pınar Obakan Yerlikaya, çift maske kullanımı hakkında şunları söyledi:

“Maskelerin özelliği virüs içeren damlacıkları bloke etmek ve solunum yolumuza girişlerini engellemek. Bu noktada maskede fiziksel bariyer ne kadar fazla olursa o kadar damlacığı bloke edebiliriz. Doğru maskeleri kullanmak da çok önemli. 3 kat içeren cerrahi maskeleri ve N95 maskeleri tercih etmek önemli. Özellikle yeni varyantlara maruz kalmamız söz konusu olduğunda hastalık geliştirme olasılığımız daha da arttığı için çift maske takmak, sosyal mesafeyi korumak, kapalı mekanlara mümkün olduğunca girmemek mutlaka alınması gereken önlemler.”

Virüs mutasyonu ve varyant kavramlarına da açıklık getiren Doç. Dr. Obakan Yerlikaya, virüslerin herhangi bir konak hücreyi enfekte etmedikleri sürece canlı yapılar olmadıklarını, çoğalmak ve canlı olmak için konak hücreye ihtiyaç duyduklarına işaret etti. Doç. Dr. Pınar Obakan Yerlikaya, “Covid-19 virüsü çoğalırken yeni oluşan virüslere aktardığı kalıtım materyali RNA. Bu nedenle bir RNA virüsü. Önce insan hücrelerini enfekte ediyor. Sonra protein meydana getirme mekanizmalarını kullanarak virüs RNA'sında kodlanmış proteinleri hücrelerimize yaptırıyor. Yani diğer bir deyişle yeni koronavirüslerin yapım fabrikası bizim hücrelerimiz oluyor” dedi.

RNA virüslerinin DNA virüslerine kıyasla daha çok mutasyon geçirdiklerini, SARS-COV-2’nin insan hücrelerine daha sıkı bağlanmak ve daha kolay çoğalmak için mutasyonlar geçirdiğini belirten Doç. Dr. Obakan Yerlikaya mutasyon sürecine ilişkin şunları ekledi:

“RNA, DNA'ya benzer olarak nükleik asitler içerir. DNA veya RNA her bölünmede yeniden sentezlenirken, yeni bir hücre veya yeni bir virüs oluşur, mutasyon denilen nükleik asit değişimleri meydana gelir. Bu değişimler virüsleri daha güçlü de kılabilir daha güçsüz de. Güçten kastettiğimiz daha bulaşıcı ya da öldürücü olmaları. Bazı virüslerin konaklarına veya ortamlarına ayak uydururken kısa zamanda adaptasyonlar geliştirdiğini görüyoruz. İşte bu adaptasyonlar da mutasyonlar oluyor.”

'S PROTEİNİNE DİKKAT'

Virüslerin bulaştıkça ve yeni konaklara girdikçe mutasyon geçirme oranlarının arttığına dikkati çeken Doç. Dr. Obakan Yerlikaya, “Viral varyant, mutasyon geçirmiş ve ilk ana virüse kıyasla yeni özellikler kazanmış alt tiptir. Örneğin yeni koronavirüsün farklı ülkelerde yeni varyantları olduğunu görüyoruz, yani o ülke nüfusu içinde yeni mutasyonlar ve dolayısı ile yeni varyantlar ortaya çıkıyor. Örneğin SARS-COV-2'nin İngiltere, Güney Afrika ve Nijerya'da varyantları gösterildi. Bunların ortak özelliği, virüsün hücrelerimize bağlanmak için kullandığı S proteinin aminoasitlerinden birinde (Spike protein) bir mutasyon taşıyor olmaları. S protein mutasyonları ile yeni varyantlar hücrelerimize daha sıkıca bağlanabiliyorlar. Böylece daha bulaşıcı ve enfeksiyöz hale geliyorlar. Sevindirici haber ise bu varyantların hastalığın seyri açısından değişiklik yaratmıyor olması” değerlendirmesinde bulundu.

TÜRKİYE’DE RASTLANAN VARYANTLAR

Ülkeler arası seyahatler ve pandemi koşullarına uyulmaması sonucu bu varyantların da dünyaya yayılmasının söz konusu olduğuna dikkat çeken Doç. Dr. Obakan Yerlikaya, mutasyonlarda pandemi önlemlerine uyulmamasının etkili olduğunu belirtti. Yerlikaya, virüsün mutasyon geçirmesini, daha bulaşıcı ya da daha öldürücü bir hal almasını engellemek için küresel önlemlerin sıkılaştırılması ve bunlara uyulması gerektiğinin altını çizdi. Türkiye'de saptanan İngiltere, Güney Afrika ve Brezilya varyantlarına ilişkin ise şunları söyledi:

"Daha bulaşıcı olan virüs versiyonu ülkemizde görülmekte. Ayrıca yapılan çeşitli çalışmalarda Türkiye’de de virüsün hem S proteini hem de yapısal olmayan diğer proteinlerini kodlayan RNA dizilerinde mutasyonlar saptandı. Fakat bu mutasyonlar özellikle virüsün bağlanma proteini olan S proteininde İngiltere, Güney Afrika varyantlarında olduğu gibi yapısal bir değişikliğe sebep olmadı. Hem yurt dışından gelen varyantların yayılmasını önlemek hem de Türkiye’de daha bulaşıcı varyantının oluşmamasını sağlamak tüm bireyler sorumluluğunda."

1 MOLEKÜLER BİYOLOJİ TEKNİKLERİ Yazarlar Doç. Dr. Ajda Çoker Gürkan Doç. Dr. Pınar Obakan Yerlikaya Doç. Dr. Elif Damla Arısan

2 2017 MOLEKÜLER BİYOLOJİ TEKNİKLERİ ISBN: Tüm hakları saklıdır ve 2936 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri yasası gereği; bu kitabın basım, yayın ve satış hakları Hipokrat Yayınevi ne aittir. Anılan kuruluşun izni alınmadan kitabın tümü ya da bölümleri mekanik, elektronik, fotokopi, manyetik kağıt ve/veya başka yöntemlerle çoğaltılamaz, basılamaz, dağıtılamaz. Tablo, şekil ve grafikler izin alınmadan, ticari amaçlı kullanılamaz. Yazarlar Doç. Dr. Ajda Çoker Gürkan Doç. Dr. Pınar Obakan Yerlikaya Doç. Dr. Elif Damla Arısan Yayıncı Hipokrat Kitabevi Grafik-Tasarım Hipokrat Grafik Tasarım Baskı - Cilt Sözkesen Matbaacılık İvedik Organize Sokak Matsit İş Merkezi No: 2/40 Tel: (0312) Yenimahalle / Ankara Süleyman Sırrı Caddesi No:16/2 Sıhhiye/ANKARA Tel: (0312)

3 Sevgili Dedem M. İlhan Çoker anısına Doç. Dr. Ajda Çoker Gürkan Sevgili Annem'e ve Babam'a Doç. Dr. Pınar Obakan Yerlikaya Sevgili Oğlum Doğukan Arısan ve tüm aileme Doç. Dr. Elif Damla Arısan

4

5 ÖNSÖZ Moleküler Biyoloji ve Genetik, Deoksiribonükleik asit (DNA), Ribonükleik asit (RNA) ve proteinler gibi makromoleküllerin, farklı model hücrelerden ve organizmalardan izole edilmesi, saflaştırılması, çoğaltılması, görüntülenmesi, enzimler ile kesilmesi, kalite ve kantitesinin belirlenmesinde kullanılan birçok tekniği bünyesinde bulunduran önemli bir bilim dalıdır. Moleküler Biyoloji ve Genetik alanında kullanılan teknikler; Tıp, Veterinerlik, Eczacılık, Ziraat, Adli Tıp, Tüp Bebek, Klinik Mikrobiyoloji, Genetik Mühendisliği gibi çeşitli bilim dallarında rutin kullanımda yer alan yöntemlerin geliştirilmesine neden olmuştur. Ayrıca son yıllarda gen mühendisliği alanındaki genom düzenleme editing yöntemlerinin keşfine bağlı olarak, çeşitli genetik hastalıklara neden olan mutasyonların silinmesi yönündeki bilimsel başarılar, Moleküler Biyoloji ve Genetik alanındaki yöntemsel yaklaşımların toplumun genelinde problemleri çözme konusunda umut vaadedici olduğunu göstermektedir. Ülkemizde sayıları artmakta olan Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü mezunlarına birçok istihdam alanında ihtiyaç duyulmaktadır. Temelde istihdam profilinde beklenti, laboratuvarda Moleküler Biyoloji ve Genetik uygulamalarına hâkim, temel yöntemler konusunda deneyimli ve var olan protokolleri geliştirebilen, teknikleri bilen ve ilişkili aletleri tanıyıp, başarılı şekilde kullanabilen Ar-Ge personelinin, bilim insanlarının yetiştirilmesidir. Bu nedenlerden dolayı, hazırlamış olduğumuz bu kitap ile ülkemizdeki Moleküler Biyoloji ve Genetik bölümleri veya benzer uzmanlık derecesi sağlayan lisans ve lisansüstü programlarında kullanılmak üzere temel Moleküler Biyoloji Teknikleri, çeşitli uygulamalar eşliğinde, görsel içerikler ile teorik-pratik açıdan rehberlik gösterebilecek bir kaynak olarak hazırlanmıştır. Kitapta, Moleküler Biyoloji laboratuvar güvenlik kuralları, kimyasal solüsyon hazırlama, farklı kökene sahip hücrelerden genomik DNA, plazmid izolasyonu teknikleri, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile hedefli DNA parçalarının çoğaltılması, kesim enzimlerinin uygulanma prensipleri ve örnekleri, agaroz ve poliakrilamid jelde görüntüleme uygulamaları, toplam RNA izolasyonu, cdna ya çevrim ve eş zamanlı Revers Transkriptaz PZR (qrt-pzr) ile gen hedeflerinin çoğaltılması, hücrelerden protein eldesi, organele özgün protein izolasyonu yöntemleri, hedef proteinlerin varlıklarının ve lokalizasyonlarının tespit edilmesinde kullanılan immunoblotlama, EMSA, ELIZA, HPLC ve 2D-DIGE yöntemlerine ilişkin teorik ve aktivite uygulamaları ile pratik kazandırılması hedeflenmektedir. Kitabımızın hazırlanması esnasında kullanılan tüm deneysel basamakların belirlenmesi, optimize edilmesi ve olası aksiliklerin üstesinden gelinmesinde İstanbul Kültür Üniversitesi, Fen- Edebiyat Fakültesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü laboratuvar alt yapısı kullanıldığı için İstanbul Kültür Üniversitesi ne teşekkürlerimizi iletmeyi borç biliriz. Bölümün kuruluşundan beri özveri ile çalışan ve bizi destekleyen hocamız Prof. Dr. Narçin Palavan Ünsal a tüm kalbimizle teşekkür ederiz. Bizlere vermiş oldukları cesaret ve hayal ettiklerimizi yapabilmemiz için sağlamış oldukları sonsuz destekleri nedeni ile saygıdeğer ailelerimize teşekkür ediyoruz.

6 vi ÖNSÖZ Moleküler Biyoloji Teknikleri kitabında yer alan DNA, plazmid, PZR, restriksiyon enzim kesimi, Elektroforez, Poliakrilamid Jel Elektroforezi, ELIZA, HPLC konuları ve aktivite çalışmalarında çizilen tüm şekiller, Servier Medical Art ile hazırlanmış ve akademik çalışmalar için kullanımı serbest olan şekil taslaklarından yardım alınmıştır. Ayrıca çeşitli kimyasalların, nükleotitlerin kimyasal yapısı için PubChem Projects in kullanıma açık olan sitesinden şekiller alınarak modifiye edilmiştir. Şekilerin çizilmesinde yardım aldığımız Servier Medical Art ve PubChem Projects sağladıkları teşekkür ederiz. Doç. Dr. Ajda Çoker Gürkan Doç. Dr. Pınar Obakan Yerlikaya Doç. Dr. Elif Damla Arısan

7 YAZARLAR Doç. Dr. Ajda Çoker Gürkan Doç. Dr. Ajda Çoker-Gürkan İstanbul Kültür Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü öğretim üyesi olarak 2010 yılından beri çalışmaktadır. Moleküler Biyoloji Teknikleri, İnsan Genetiği, Genetik Mühendisliği, Transgenik Hayvan Modelleri, İmmunoloji lisans, Kanser İmmunolojisi, İleri Moleküler Genetik ve Moleküler İmmünoloji yüksek lisans-doktora dersleri veren Dr. Çoker-Gürkan, lisans eğitimini Marmara Üniversitesi nde tamamlamıştır. Otoimmun hastalıklar (Koroner Arter, Multiple Sikleroz, Parkinson Hastalığı) ile ilişkili sitokin genlerindeki tek nükleotit değişiklikleri üzerine Yüksek Lisans çalışmasını 2005 yılında, Büyüme Hormonu (BH) geni klonlanması ve BH mutasyonlarının biyolojik fonksiyonlarının in vitro ortamda gösterilmesi üzerine Doktora tezini 2009 yılında Marmara Üniversitesinde tamamlamıştır. Dr. Çoker-Gürkan kolon ve meme kanseri hücrelerinde çeşitli ilaç adaylarının moleküler etki mekanizmalarının hücre içi sinyal yolakları aracılı aydınlatılması, yeni ilaç hedeflerinin moleküler hedeflerinin tanımlanması, biyomarkır araştırmaları ile Caenorhanditis elegans hayvan modellerinde nörodejeneratif hastalık modeli üzerinde in vivo çalışmalarını devam ettirmektedir. DAPGenomik isimli bir startup firmasının eş kurucusudur. Doç. Dr. Çoker Gürkan nın Science Citation İndex (SCI) kapsamında kırk adet makalesi, dördü sözlü sunum biri davetli konuşmacı olmak üzere, yetmişten fazla uluslararası bildirisi, Autophagy in Current Trends in Cellular Physiology and Pathology, Breast Cancer-From Biology to Medicine ve Functional Food kitaplarında bölüm yazarlığı bulunmaktadır yılında İstanbul da düzenlenen Uluslararası Poliamin Kongresinin ve birçok ulusal/uluslararası sempozyumun organizasyon komitesinde yer almıştır. Dr. Çoker Gürkan ın iki TÜBİTAK 1001, iki TÜBİTAK 1002 proje yürütücülüğü ile TÜBİTAK 1512 eş-yürütücülüğü yapmıştır. European Cooperation in Science and Technology (COST) AB projesi araştırıcılığı ve TÜBİTAK2024-Ufuk2020 eşik üstü ekip ödülü bulunmaktadır.

8 viii YAZARLAR Doç. Dr. Pınar Obakan-Yerlikaya Doç. Dr. Pınar Obakan-Yerlikaya, İstanbul Kültür Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü öğretim üyesi olarak 2013 yılından beri çalışmaktadır. Moleküler Biyoloji Teknikleri, Sinir Bilimi, RNA Biyolojisi, Hücre Doku Kültürü, Enzimoloji lisans ve Nükleik Asit Metabolizması, Araştırma Teknikleri, Nörodejenerasyon yüksek lisans-doktora dersleri veren Dr. Obakan Yerlikaya, lisans eğitimini İstanbul Üniversitesi nde tamamlamıştır. Yüksek lisans eğitimini Türk Eğitim Vakfı-Fransa Büyükelçiliği Bursu ile Fransa da Université de Paul Sabatier, Toulouse III de hücre moleküler biyolojisi alanında tamamlamıştır. İstanbul Üniversitesi nden doktora derecesi ile mezun olmuştur. Çalışma konuları, farklı kanser ve nörodejeneratif hastalık modellerinde (in vitro hücre kültürü ve Caenorhanditis elegans modeleri) çeşitli ilaç adaylarının moleküler hedeflerinin belirlenmesi üzerinedir. DAPGenomik isimli bir start up firmasının eş kurucusudur. Doç. Dr. Obakan Yerlikaya nın Science Citation İndex (SCI) kapsamında yirmi iki adet makalesi, dördü sözlü sunum biri davetli konuşmacı olmak üzere, altmıştan fazla uluslararası bildirisi, Autophagy in Current Trends in Cellular Physiology and Pathology, Breast Cancer-From Biology to Medicine ve Functional Food kitaplarında kitap bölümü yazarlığı bulunmaktadır yılında Amerika Birleşik Devletleri nde düzenlenen Gordon Research Seminar on Polyamines in eş başkanlığını, İstanbul da düzenlenen Uluslararası Poliamin Kongresinin ve birçok uluslararası sempozyumun organizasyon komitesinde yer almıştır. European Cooperation in Science and Technology (COST) AB projesi ve TÜBİTAK 3001 projelerinin yürütücülüğünü, TÜBİTAK 1512 eşyürütücülüğü ile üç adet TÜBİTAK1001 projesi araştırmacılığı yapmıştır. TÜBİTAK2024-Ufuk2020 eşik üstü ekip ödülü bulunmaktadır.

9 YAZARLAR ix Doç. Dr. Elif Damla Arısan Elif Damla Arisan İstanbul Kültür Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü öğretim üyesi olarak 2006 yılından beri çalışmaktadır. Aynı zamanda İstanbul Kültür Üniversitesi, Teknoloji ve Proje Destek Birimi, Proje Koordinatörlüğü görevini yürütmektedir yılında Sabancı Üniversitesi, Biyolojik Bilimler ve Biyomühendislik Doktora programından mezun olmuştur yılında Marmara Üniversitesi Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalında yüksek lisans çalışmalarını tamamlamıştır. Lisans mezuniyeti Marmara Üniversitesinden 1999 yılındadır akademik yılında Harvard Üniversitesi Global Extention School kapsamında Cancer Biology and Therapeutics isimli bir programda fellow olarak yer almıştır yılında Sabancı Universitesi EFSUN Mükemmeliyet merkezi çalışma grubuna davet edilmiştir. Çalışma alanları hücre moleküler biyolojisi, kanser biyolojisi, biyomarkır araştırmaları olup, yeni ilaç hedeflerinin moleküler hedeflerinin tanımlanması, hücre sinyal yolakları ve hücre moleküler etkileşimleri üzerine akademik araştırmalarını yürütmektedir. Avrupa Birliği tarafından desteklenen veya TÜBİTAK destekli birçok projede yürütücü, araştırmacı ve danışman gibi görevler üstlenmiştir. 40 ın üzerinde akademik SCI indekslerinde yayınlanmış yayını, İstanbul Kültür Üniversitesi, DNA okulu kapsamında yayınlanmış moleküler biyoloji teknikleri konusunda bir kitapta iki bölüm yazarlığı, Türkçe hazırlanan bir kanser kitabında bölüm yazarlığı, biri SCI kitap indeksli olmak üzere üç kitapta bölüm yazarlığı (İngilizce dilinde hazırlanan) gibi akademik çıktıları mevcuttur. Ayrıca DAPGenomik isimli bir startup firmasının eş kurucusudur. En iyi tez ödülü, en iyi yayın ödülü, TÜBİTAK2024-Ufuk2020 eşik üstü ekip ödülü, gelecek vaad eden Kanser Araştırmacısı, Gürsel Sönmez ödülü gibi ödüller ile onurlandırılmıştır. Evli ve bir çocuk sahibidir.

10

11 İÇİNDEKİLER Önsöz...v Yazarlar...vii İçindekiler...xi Kısaltmalar...xv Sembol Listesi...xvii BÖLÜM 1 BİYOGÜVENLİK KURALLARI VE DENEYSEL HAZIRLIK AŞAMALARI Moleküler Biyoloji Teknikleri Laboratuvarı ve Biyogüvenlik Kuralları...3 Biyogüvenlik Kuralları...3 Yasaklayıcı İşaretler...3 Uyarı İşaretleri...3 Emredici İşaretler...4 Acil Çıkış ve İlkyardım İşaretleri...4 Yangınla Mücadele İşaretleri...4 Kişisel Açıdan Dikkat Edilmesi Gereken Kurallar...4 Laboratuvardaki Aletler ile ilgili Dikkat Edilmesi Gereken Kurallar...4 Laboratuvarda Kullanılan Kimyasallar ile ilgili Dikkat Edilmesi Gereken Kurallar...5 Kimyasallarla çalışma ilkeleri...6 MSDS formları okunan ve tehlike işaretleri ile özellikleri belirlenen kimyasallar depolanırken belirli koşullara dikkat edilir:...6 Laboratuvarda kullandığımız kimyasalların insan vücuduna zararları...6 Kimyasallara Maruz Kalındığında Yapılması Gerekenler...7 Kimyasal Atıkların Uzaklaştırılması...7 Enfeksiyöz Materyallerle Çalışma İlkeleri...7 Moleküler Biyoloji Teknikleri Laboratuvarındaki Çalışma Koşulları Bilgilendirme Onay Formu...8 Kimyasal Çözelti Hazırlama...8 Ağırlıkça Yüzde (w/w)...8 Hacimde Ağırlıkça Yüzde (w/v)...8 Hacimce Yüzde (v/v)...8 Örnek Sorular:...8 ph Metre ve Kullanımı...9 ph Metre Kalibrasyonunda Kullanılan Solüsyonların Hazırlanması...9 ph Metre Kullanırken Dikkat Edilmesi Gerekenler...9 Mikropipet Kullanımı...9 Mikropipet Nasıl Kullanılmalıdır?...10 Mikropipet Uçları...10

12 xii İÇİNDEKİLER BÖLÜM 2 DNA İZOLASYON PRENSİPLERİ VE ANALİZ YÖNTEMLERİ Farklı Kaynaklarda DNA İzolasyonu...15 Memeli Hücrelerinden (Hücre Kültürü Temelli) DNA İzolasyonu...15 Kandan DNA İzolasyonu...18 Bakteriden Genomik DNA ve Plazmid İzolasyonu...20 DNA nın Kalitatif ve Kantitatif Analizi...24 DNA nın Spektral Analizi...24 Biyolojide Önem Taşıyan Elektromanyetik Işınımlar...25 Agaroz Jel Elektroforezi...26 Agaroz Jel Elektroforezi Birbirini İzleyen Basamaklardan Oluşur...27 BÖLÜM 3 POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PZR) OPTİMİZASYONU VE PZR TİPLERİ Polimeraz Zincir Reaksiyonu...35 Her Bir PZR Döngüsünün Basamakları...35 Günümüzde PZR Kullanım Alanları...37 PZR Reaksiyon İçerikleri...37 Kalıp DNA...37 Primer...38 Primer Tasarımının İki Önemli Amacı Bulunmaktadır...39 PZR İçin Primer Setlerinin Oluşturulmasında Çeşitli Kriterler Önem Taşır...39 DNTP (Deoksinükleotidtrifosfat)...41 DNA polimeraz...41 MgCl 2 /KCl /MgSO Distile Su...42 PZR Tipleri...44 Nested PZR...44 Long PZR...46 Long PZR İçin Olası Kullanılacak DNA Polimerazlar...47 Long PZR Kullanım Amaçları...47 Restriksiyon Enzim Kesimi ve Restriksiyon Enzim Fragment Length Polymorphism (RFLP)...48 RE ler Günümüzde Moleküler Biyoloji ve Genetik Alanında Çok Farklı Amaçlarla Kullanılmaktadır:...50 Farklı Genom Bölgelerindeki SNP lerin RFLP Yöntemi ile Gösterilmesi...50 BÖLÜM 4 RNA İZOLASYONU PRENSİPLERİ VE ANALİZ YÖNTEMLERİ RNA İzolasyonu...59 İzole Edilen RNA nın Görüntülenmesi...62 RNA Analiz Teknikleri...63

13 İÇİNDEKİLER xiii BÖLÜM 5 PROTEİN İZOLASYON PRENSİPLERİ VE ANALİZ YÖNTEMLERİ Farklı Kaynaklardan Protein İzolasyonu...71 Proteinlerin Kalitatif ve Kantitatif Analizi...75 Proteinlerin Spektral Analizi...75 ELIZA Yöntemi...76 HPLC Yöntemi...78 Proteinlerin Elektroforetik Analizi...80 Özgün Proteinlerin Elektroforetik Yöntemler Sonrası Görüntülenmesi...84 İmmunoblotlama D Jel Elektroforezi...86 Elektroforetik Mobility Shift Assay (EMSA)...88 EMSA Jel Hazırlanışı...89 EKLER...93

14

1510H 2 0 Na 2 HPO 4 NaCl NaF NaOH : mutant : Boraks : Disodyum hidrojen fosfat : Sodyum Klorür : Sodyum Florür : Sodyum Hidroksit EMSA : Elektromobilite Shift Assay NBT : Nitro Blue Tetrazolium Klorür ER : Endoplazmik Retikulum NH 4 Ac : Amonyum Asetat EtBr : Etidyum Bromür NH 4 Cl : Amonyum Klorür EtOH : Etil Alkol NP40 : 4-Nonilfenil poli etilen glikol FBS : Fetal Sığır Serum nt : Nükleotit G : Guanin PBS : Fosfat tamponlu tuz çözeltisi

16 xvi KISALTMALAR PEEK ph PMSF PVDF PZR qrt-pzr RE RFLP RNA rrna RT-PCR SDS SDS-PAGE SNP snrna T TAE TBE TBS TCA TE TEMED Tm TMB TNT trna U Wt : Polieter Eter Keton : Power of Hidrojen : Fenolmetil Sulfonil Florit : Poliviniliden fluorid : Polimeraz Zincir Reaksiyonu : Kuantatif Revers Transkripstaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu : Restriksiyon Enzimi : Restriksiyon Enzim Kesim Polimorfizmi : Ribo Nükleik Asit : Ribozomal Ribo Nükleik Asit : Revers transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu : Sodyum dodesil sülfat : SDS- Poliakrilamid Jel Elektroforezi : Tek Nükleotit Polimorfizmi : Küçük Nüklear RNA : Timin : Tris Asetik Asit EDTA : Tris Borik Asit EDTA : Tris tamponlu tuz çözeltisi : Trikloroasetik asit : Tris EDTA : Tetrametletilendiamin : Erime Sıcaklığı : 3,3,5,5 -Tetrametil benzidin : Trinitro Toluen : Transfer RNA : Urasil : Doğal tip

17 SEMBOL LİSTESİ % GC : Yüzde Guanin Sitozin İçeriği % : Yüzde bç : Baz çifti cm : Santimetre cm 2 : Santimetre kare Da : Dalton dk : Dakika g : Gram kb : Kilo baz kda : Kilo Dalton L : Litre ma : Mili amper Mb : Mega baz ml : Mililitre mm : Milimetre ng : Nano gram nm : Nanometre ºC : Santigrat derece OD : Optik Densite pmol : Picomol rpm : 1 dakikadaki devir sayısı sn : saniye U : Unite v : Hacim V : Volt w : Ağırlık μg : Mikrogram μl : Mikro Litre μm : Mikro Molar

18