Gümüş Boyama Yöntemi

GÜMÜŞ ÇÖKTÜRME YÖNTEMLERİ

Altın ve gümüş tuzlarının kullanıldığı yüzlerce teknik vardır. Bu teknikleri ilk kez Ramon y Cajal kullanmıştır. Camillo Golgi () ve Santiago Ramon y Cajal () ın geliştirdikleri teknikler önem taşır. Bu araştırıcılar sinir doku gösterimi üzerine çalışmalarından dolayı Nobel ödülünü paylaşmışlardır. Bu yöntemler özellikle glial elementlerin gösterimi için uygundur. Her iki araştırıcı da sinir sistemi çalışmaları için bilimde çok önemli yer tutar. Golgi günümüzde hala sinir hücreleri ve fibrilleri için çok kullanılan birçok boya geliştirmiştir. Tekniğinde aldehit-osmiyum-dikromat çözeltisini fiksatif olarak kullanmıştır. Ardından gümüş tuzları ile impegne etmiştir. Perikaryonlar altın rengi uzantıları siyah olarak gösterilebilir. Nöral dokuların şekillerini ve bağlantılarını ortaya koymuşlardır. Gümüşleme ile nöronlar ve glial hücreler gösterilebilir. Ramon y Cajal tekniğinde gümüş çöktürüldüğünde nöronlar sarı/turuncu renkte, nörofibriller kahverengi-siyah arası, nöroglialar ise siyah olur. Gümüşlemede sadece nöroglialar siyahlaşır.
Metalik çöktürme teknikleri, sinir hücre uzantıları ve retiküler fibrillerin gösteriminde standart bir yöntemdir. Metalik çöktürme ile gösterim, dokulardaki indirgeyici ajanlar yeterli güçte ise tek basamaklı bir tekniktir. Fakat fibrillerin çöktürme ile gösteriminde argirofil hücrelere benzer olarak genellikle 2 basamaklı indirgenme olur. Gümüş yerine altın da kullanılabilir.
Bazı metalik bileşikler dokular tarafından opak, genellikle siyah birikinti oluşturarak metalik duruma indirgenebilirler. Kolayca indirgendiğinden ve depo edilmiş gümüş stabil olduğundan Ag(NH3)2OH çözeltileri histoloji için çok uygundur. Melanin gibi tirozin türevleri ve intestinal bezlerin Kultschitzky hücrelerinde bulunan fenolik bileşikler Ag(NH3)2OH’ ı görülebilen birikim oluşturarak indirgerler. Bu tip hücreler arjentaffin hücreler olarak bilinir. Ag(NH3)2OH’ı direkt olarak indirgeyemeyen fakat dışarıdan eklenen bir indirgeyici ajanla gerçekleştiren hücreler argirofil hücreler olarak bilinir.

1-Golgi Teknikleri: Golgi çöktürmeler boya değildir. Bu teknikle tüm hücre gövdesi ve dendritler izlenebilir. Miyelinli aksonlar tuzları biriktirmezler. Miyelinsiz yapılar olan terminal son düğmecikler tuzlarla dolabilir. Uzun (bazıları birkaç ay) ve karmaşık yöntemlerdir. Sinir hücre ve uzantılarını dens siyah bir impregnasyonla gösterirler. Hücre iç yapısı kararırken, aksonlar ise genellikle sadece miyelin tabakası olmadığında impregne olurlar. Golgi' nin 3 yöntemi bilinmektedir. Hızlı, yavaş ve karışık olmak üzere
Yavaş Teknik:Küçük organ parçaları Müller çözeltisine veya % kaliumbikromat çözeltisine atılır. Karanlıkta veya kahverengi bir şişe içerisinde hafta saklanır. Bu süre sonunda deneme için bir parça alınır. Süzgeç kağıdı ile kurutularak % 0,75 ‘lik gümüş nitrat çözeltisinde 24 saat bırakılır. Hafifçe bistüri ile çok ince bir kaç kesit lama alınır, mikroskopta bakılır. Gümüş empregnasyonu (çökme) görülmezse kaliumbikromat çözeltisine bırakılır. Görülürse % 40’ lık alkol içerisinde yıkanır ( saatte bir alkol yenilenir). Ardından % 80 ve % 90'lık alkollerden geçirilir. Absolu alkolde 12 saat bırakıldıktan sonra yarı yarıya eter- alkol çözeltisine aktarılır.
1 gün % 2 celloidin
1 gün % 4 celloidin
1 gün % 8 celloidin
% 8 celloidin ile bloklanır. Bloklar %96’ lık alkolde saklanır. Alınan kesitler yine % 96’ lık etil alkol içine alınarak ardından absolu alkolden geçirilir. Karbolksild konarak kapatılır.
Hızlı Teknik:Çok ince ve taze parçalar tercih edilir.
Golgi Çözeltisi
% 1’lik osmiyum acid 10cc
% 2,5 -3,5 kalium bikromat 40cc
mm kalınlığındaki mm genişliğindeki doku parçaları dibinde cam boncuk bulunan kahverengi şişe içindeki Golgi çözeltisine aktarılır. 50 cc’lik Golgi çözeltisine bu büyüklükteki 6 parça konabilir. Parçaların çözelti içinde ne kadar kalacağı önceden söylenemez. Süre parçaya göre değişir. Onun için aynı yerlerden birkaç parça alıp atmalı ve zaman zaman ( güne kadar) parçalar çıkarılarak papier buharla kurutulmalıdır. Parçalar % ’ lik gümüş nitrat çözeltisine aktarılırak gün bırakılır ( 48 saat ). Çözelti sararırsa veya bulanırsa yenilenmesi gerekir. % 40’ lık etil alkol içinde saat yıkanır. Alkol sık sık yenilenmelidir. % 80–90 ve absolü alkollerden geçirilerek yarı yarıya eter-alkol eriyiğinde 1 gün ; % 2’ lik celloidinde 1 gün, % 4’lik celloidinde 1 gün bırakılır. % 8’lik celloidinde saklanır. Kesitler alınarak %96’lık etil alkol içine alınır. Ardından absolü alkolden geçirilerek karboliksilde konur kapatılır.

Kromzom Bantlama Teknikleri

İnsan sito-genetiği, Yüzyılın sonlarında, kromozomların yapı, işlev ve evrimini araştıran bir araştırma alanı olarak ortaya çıkmıştır. Flemming ’de ilk kromozom çizimlerini yayımlamış, ’de ise ilk kez Waldeyer ‘’Kromozom’’ terimini kullanmıştır. yılında ise Hsu, ford ve Levan insan kromozomlarının sayısının ‘’ 2n=46 ‘’ olduğunu göstermiştir. ’li yılların başında G-, R-, C- ve NOR bantlama teknikleri başarılı uygulamalarda kullanılmaya başlanmıştır. Bunu High-Resulation bantlama teknikleri ve FISH teknikleri izlemiştir.

Kromozom Morfolojisi Ve Sayısı

Karyotip; Bir birey veya bir türün kromozom morfolojisi, sayısı ve büyüklüğünü ifade etmektedir.

İdiogram; kromozomöarın grafik olarak gösterimidir ve bir hücre içindeki ölçüm ve gözlemlere dayanmaktadır.

Karyotipler ‘’Mayotik’’ ve ‘’Mitotik’’ kromozomlara dayanmaktadır ve kromozom bantlama yöntemleri ile detaylı bir biçimde analizi yapılabilmektedir. Kromozomlar genellikle en büyük kromozomdan en küçüğüne doğru sıralanmaktadır.

Kromozomların Gözlemlenmesinde Kullanılan Kimyasallar

• Hücre bölünmesinin teşviki
• Fitohemaglutinin
• Hidroksiürea, Ametopterin, Soğuk uygulaması
• Kolsişin, a-bromonaftalin, Hidroksikuinolin, Hipotonik uygulaması
• Feulgen ( DNA’ya özel), Giemsa, Karmin
• Hücre eşleşmesi
• İğ ipliklerinin durdurulması ve kromozomların ayrılması
• Kromozom boyama

Kromozom Bantlama Tekniklerinin Tarihçesi

Kromozom Bantlama Yöntemleri

Kromozomal Bantlar

Ana band bölgeleri sayılar ile gösterilir.

Kromozom Bantlama Yöntemleri  

• Q- Bantlama
• G- Bantlama
• C- Bantlama
• R- Bantlama
• T- Bantlama
• Gümüş ( NOR ) Boyama
• DAPI Distamisin A Boyama

Q- Bantlama;

İnsan kromzomlarını tanımlamak için kullanılan ilk yöntemdir. Kromozomlar floresan boya ile boyanır. Bu bantlama ile spesifik kromozomların ve yapısak yeni düzenlemelerin belirlenmesi sağlanmaktadır. Özellikle Y Kromozomunun ( aynı zamanda interfaz nukleusunda ki Y cisimciğininde ) ve satallitlerle bağlantılı çeşitli polimorfizmlerin ve spesifik kromozomların sentromerlerinin ayrımında kullanılmaktadır. A-T’ den zengin bölgeler daha parlak olarak boyanmaktadır.

G- Bantlama;

En sık kullanılan bantlama yöntemidir. Preparatlar bir proteaz olan tripsin ile muamele edilerek histon ve non-histon proteinler denatüre edilir. Sonuçta açıkta kalan DNA giemsa ile boyanır.  G bantlama ile arasında bant değerlendirilir.  Böylece A-T açısından zengin olan bölgeler daha koyu boyanır. Bu bantlar kromozoma özgüdür ve kromozomların kesin tanısında kullanılmaktadır. Ayrıca bu bantlar sayesinde translokasyon, inversiyon, delesyon gibi kromozomal hastalıkların belirlenmesinde kullanılmaktadır.

C- Bantlama;

Özellikle sentromerik bölgelerin boyanmasında ve diğer heterokromatin yapı içeren bölgelerin boyanmasında kullanılmaktadır. Örneğin; insan kromozomlarından 1, 9, 16 ‘nın ikincil kontriksiyonlarında ve Y kromozomunun uzun kolunun distal parçasında heterokromatin yapılar bulunmaktadır.

R- Bantlama;

R- Bantlama ile G bantlamanın tam tersi bir bant örneği elde edilmektedir. C-G’den zengin ökromatin bölgeler koyu renk veya parlak floresan boyanırlar. A-T’den zengin heterokromatin bölgeler ise açık renk veya flouresan mat boyanırlar. G ve Q bantlamada soluk olarak boyanan telomerik bölgelerin koyu olarak boyanmasına imkan tanır. Kromozomların uç kısımlarını kapsayan anomalilerin değerlendirilmesinde kullanılmaktadır.

T- Bantlama;

Telomeri boyamam için kullanılan tekniktir.

Gümüş (NOR) Boyama;

Bu yöntemle yalnızca akrosentrik kromozomların satellitlerindeki nukleolus organizasyonundan sorumlu bölgeler boyanmaktadır. Bu bölgelerde ribozomal RNA yada proteinler içeren genler bulunur ve gümüş nitrat ile boyanmaktadır.

DAPI Distamisin A Boyama;

İnsan kromozomlarının 1., 9., , ve Kromozomları, Y kromozomunun uzun kolunu boyar ve perisentrik kırılma noktalarının belirlenmesinde kullanılmaktadır.

Şevval ÇAKIR

Kaynakça;

1. seafoodplus.info
2. seafoodplus.info
3. seafoodplus.info?sequence=2&isAllowed=y
4. seafoodplus.info&#;bantlama-
5. seafoodplus.info?Resim=8&SSNO=2&USER=

Summary

Burada, biz yeni bir floresan polyacrylamide jellerin toplam protein algılaması için teknik boyama özetleyen bir detaylı iletişim kuralı tanımlamak. Ag⁺algılar bir gümüş iyon özgü Floresans tahrik sonda protokol kullanır-protein kompleksleri ve geleneksel chromogenic gümüş lekeler belirli sınırlamaları ortadan kaldırır.

Abstract

Gümüş boyama polyacrylamide Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) takip jelleri bantlarında protein görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir Renkölçer tekniktir. Klasik gümüş lekeleri yüksek arka plan boyama, zavallı protein kurtarma, düşük tekrarlanabilirlik, miktar ve kütle spektrometresi (MS) ile sınırlı uyumluluk için dar bir doğrusal Dinamik Aralık gibi bazı dezavantajları var. Şimdi, bir fluorogenic Ag⁺ sonda, TPE-4TA, kullanımı ile floresan bir gümüş boyama yöntemi polyacrylamide jellerin toplam protein görselleştirme için geliştirdik. Bu yeni leke geleneksel gümüş lekeleri zahmetli gümüş azaltma adımda önler. Ayrıca, floresan gümüş leke iyi tekrarlanabilirlik, ışık hassasiyeti ve protein bulunması, yapım o bir yararlı ve pratik protein jel leke doğrusal miktar gösterilmektedir.

Introduction

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bu floresan gümüş boyama üzerinde bir patent başvurusu şikayetçi oldu.

Acknowledgments

Yazarlar Patrick Chan Ming Wai Lau merkezinde onarıcı tıp, Karolinska Institutet, onun teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. S. X. İsveçli Araştırma Konseyi (Grant No ) destek için minnettar olduğunu.

Materials

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

1. Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics.Proteome Science. 8 (1), ().
2. Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses.Journal of Proteome Research. 6 (4), ().
3. Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods.Journal of Chemical Biology. 4 (1), ().
4. Candiano, G., Bruschi, M., et al.Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G staining for proteome analysis.Electrophoresis. 25 (9), ().
5. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels.Nature Protocols. 1 (4), ().
6. Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer.Electrophoresis. 25 (15), ().
7. Celis, J. E., et al.Cell Biology: A Laboratory Handbook. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. ().
8. Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels.Methods in Molecular Biology. (1), ().
9. Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview.Cellular and Molecular Biology. 40 (1), ().
10. Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis.Advances in Protein Chemistry. 65 (1), ().
11. Xie, S., et al.Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining.Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), ().
12. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from: seafoodplus.info ().

Gümüş boyama nedir?

Gümüş boyama, jellerdeki proteinlerin saptanması ve tanımlanması için kullanılan güçlü ve çok yönlü bir tekniktir. Bu teknik, gümüşü karboksil ve sülfhidril grupları gibi amino gruplarının kimyasal terminal veya yan zincirlerine bağlayarak gerçekleştirilir. Onlarca yıldır, poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak proteinleri ayırmak için gümüş boyama kullanılmıştır. Çekirdeklenme bölgeleri olarak bilinen proteinlerdeki küçük yarıklar, gümüş iyonlarının daha sonra kolaylıkla tespit edilebilen mikroskobik gümüş kristallerine indirgenmesini destekler.

Gümüş boyama, minimum arka plan gürültüsü ve kütle spektrometresinden azaltılmış parazit ile net görüntüler üreten, protein tespiti için oldukça hassas ve spesifik bir yöntemdir. Genel gümüş boyama işlemi, gümüşü sabitlemeyi, hassaslaştırmayı, gümüşle emprenye etmeyi ve bir görüntü geliştirmeyi içerir. Bu tekniğin çeşitli varyasyonları vardır; bazılarının tamamlanması yalnızca bir saat sürerken bazılarının tamamlanması 24 saatten fazla sürer. Tamamlandığında, leke birkaç hafta boyunca stabil kalabilir ve bu da uzun süreli gözleme izin verir.

Gümüş boyamanın tarihi, Fransız kimyager Louis-Emile Javal'ın sinir liflerini görselleştirmek için bir yöntem olarak tekniği ilk kez geliştirdiği yüzyılın sonlarına kadar uzanır. Bununla birlikte, tekniğin jellerdeki proteinlerin saptanmasında kullanılmak üzere uyarlanması yüzyılın başlarına kadar değildi. O zamandan beri, gümüş boyama, protein kimyasının temel unsuru haline geldi ve kan ve dokulardaki proteinlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli araştırma ve klinik uygulamalarda yaygın olarak kullanıldı.

Yıllar boyunca, gümüş boyama tekniği, hassasiyetini ve özgüllüğünü artırmak için çeşitli modifikasyonlar getirilerek rafine edilmiş ve geliştirilmiştir. Günümüzde gümüş boyama, protein kimyası alanında önemli bir araç olmaya devam ediyor ve biyolojik süreçler ve hastalık mekanizmalarının incelenmesinde çok önemli bir rol oynamaya devam ediyor. Daha yeni ve daha gelişmiş tekniklerin ortaya çıkmasına rağmen, gümüş boyama, güvenilirliği ve çok yönlülüğü nedeniyle yaygın olarak kullanılmaya devam ediyor ve bu da onu protein kimyagerlerinin araç setinin önemli bir parçası haline getiriyor.

Gümüş boyama prensibi

Gümüş boyama, jellerdeki proteinleri görselleştirmek için kullanılan basit ama güçlü bir tekniktir. İşlem, çözünmeyen metalik gümüş oluşumuna yol açan, protein moleküllerinin çevresindeki gümüş iyonlarının seçici olarak indirgenmesini içerir. Gümüş emdirme aşaması, alkali protokol ve asidik protokol tarafından tanımlanan iki ana gümüş boyama protokolü vardır.

Alkali Protokolü: Gümüş Nitrattan Oluşan Bir Diamin Kompleksi – Alkali protokol, amonyum ve sodyum hidroksitten oluşan alkali bir ortamda gümüş nitrattan oluşan bir diamin kompleksi kullanır. Protein modelleri formaldehitin seyreltik asidik çözeltilerinde geliştirilir. Bu yöntem, ilgili proteinin asidik koşullara duyarlı olduğu uygulamalar için idealdir.

Asidik Protokol: Sudaki Gümüş Nitrat Çözeltisi – Buna karşılık, asidik protokol, jel emdirme için suda gümüş nitrat çözeltisi kullanır. Protein modelleri, amonyak ve sodyum hidroksitin alkalin ortamı altında formaldehit solüsyonunda geliştirilir. Bu yöntem, ilgili proteinin alkali koşullara duyarlı olduğu uygulamalar için tercih edilir.

Başarılı Gümüş Boyama Adımları Gümüş boyama işlemi, fiksasyon, jel işlemi, gümüş emdirme ve jel durulama dahil olmak üzere dört ana aşamaya ayrılabilir.

• Tespit: Proteinleri Hareketsizleştirme ve Etkileşen Bileşikleri Uzaklaştırma – Gümüş boyama işlemindeki ilk adım, proteinlerin immobilize edildiği ve herhangi bir engelleyici bileşiğin çıkarıldığı fiksasyondur. Bu aşama, proteinlerin boyama için doğru konumda olmasını sağlar ve örneğin bütünlüğünün korunmasına yardımcı olur.
• Jel Tedavisi: Protein Reaktivitesini ve Gümüş İndirgemesini Hızlandırma – İkinci aşama, gümüş ve/veya gümüş indirgemesine karşı protein reaktivitesini hızlandıran elementlerin eklenmesini içeren jel işlemidir. Bu aşama, numuneyi gümüş emdirmeye hazırlamak için hassaslaştırma ve yıkama adımlarını içerir.
• Gümüş Emprenye: Düz Gümüş Nitrat veya Amonyak Gümüşü Kullanma – Üçüncü aşamada, kullanılan protokole bağlı olarak numune saf gümüş nitrat veya amonyak gümüşü ile emprenye edilir. Bu aşama, numunedeki proteinlerin başarılı bir şekilde görselleştirilmesi için kritik öneme sahiptir.
• Jel Durulama: Gümüş Metal Görüntünün Elde Edilmesi – Son aşama, bağlanmamış gümüş iyonlarını uzaklaştırmak ve gümüş metal görüntüsünü elde etmek için numunenin yıkanmasını içeren jel durulamadır. Üretilen görüntü tonları, gümüşe bağlı protein bantlarının sayısına bağlıdır.
• Proteinleri Çarpıcı Ayrıntılarla Görselleştirmek – Gümüş lekeli protein bantları, lekeli gümüşün renk yoğunluğuna bağlı olarak koyu kahverengi veya siyah görünür. Renkteki varyasyonlar, farklı boyutlardaki gümüş taneciklerinin dağınık kırınımlarına bağlanır. En küçük protein miktarlarını bile saptayabilen gümüş boyama, jellerdeki proteinleri görselleştirmek için çok yönlü ve etkili bir yöntemdir.

Sonuç olarak, gümüş boyama, gümüş emdirme aşaması tarafından tanımlanan iki ana protokol ile jellerdeki proteinleri görselleştirmek için güçlü bir tekniktir. Alkali veya asidik protokolü seçin, en küçük protein miktarlarını bile tespit etme yeteneği ile çarpıcı sonuçlar bekleyebilirsiniz.

gümüş lekesinin özellikleri

Gümüş boyama, 'lerin başına kadar uzanan bir geçmişe sahip, jellerdeki proteinleri görselleştirmek için kullanılan güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, gümüş lekesinin de onu benzersiz bir madde yapan bazı ilginç fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip olduğunu biliyor muydunuz? Bu bölümde, gümüş lekesinin özelliklerine ve onu laboratuvarda değerli bir alet yapan şeyin ne olduğuna daha yakından bakacağız.

• Kaynama Noktası: Yüksek Sıcaklıklara Ulaşmak – Gümüş lekesinin kaynama noktası °C'dir ( °F), bu da onu yüksek sıcaklıklara dayanabilen bir madde yapar. Bu özellik, protein görselleştirme sürecine müdahale edebilecek herhangi bir safsızlığı gidermek için lekeyi ısıtırken kullanışlıdır.
• Erime Noktası: Katıdan Sıvıya Dönüşüm – Gümüş leke ayrıca, maddenin katıdan sıvıya dönüştüğü sıcaklık olan °C ( °F) erime noktasına sahiptir. Bu özellik, lekeyi laboratuvarda kullanılmak üzere hazırlarken göz önünde bulundurulması önemlidir.
• Buharlaşma Isısı: Maddeye Enerji Verilmesi – Gümüş lekesinin buharlaşma ısısı, maddeyi sıvıdan gaza dönüştürmek için gereken enerji miktarı olan kJ/mol'dür. Bu özellik, leke ile vakumda veya düşük basınç altında çalışırken dikkate alınması önemlidir.
• Yoğunluk: Birim Hacim Başına Kütlenin Ölçülmesi – Gümüş leke, maddenin birim hacmi başına kütle ölçüsü olan g/cm3 yoğunluğa sahiptir. Bu özellik, belirli bir numune boyutu için gereken leke miktarını belirlemek için kullanışlıdır.
• Molar Isı Kapasitesi: Enerji Aktarımının Ölçülmesi – Gümüş lekesinin molar ısı kapasitesi, maddenin sıcaklığını bir derece değiştirmek için gereken enerji miktarının bir ölçüsü olan J/(mol·K)'dir. Bu özellik, laboratuvarda kullanılmak üzere lekeyi ısıtırken göz önünde bulundurulması önemlidir.

Sonuç olarak, gümüş lekesi, jellerdeki proteinleri görselleştirmek için çok yönlü ve değerli bir araçtır. En küçük protein miktarlarını bile tespit etme kabiliyetine ek olarak, gümüş lekesi ayrıca kaynama noktası, erime noktası, buharlaşma ısısı, yoğunluk ve molar ısı kapasitesi dahil olmak üzere bir dizi ilginç fiziksel ve kimyasal özelliğe sahiptir. Bu özellikleri anlamak, laboratuvar deneylerinizde gümüş lekesinden en iyi şekilde yararlanmanıza yardımcı olabilir.

Gümüş boyama için gerekli reaktifler ve solüsyonlar

• Örnek tampon: 2 mL 10 M üre, 25 uL % fenol kırmızısı, mL su, 50 mg SDS.
• %3 Akrilamid Çözeltisi: Bu çözelti, ml M Tris-HCl, pH , ml % (a/h) akrilamid ve % (a/h) bisakrilamidin ml su içinde birleştirilmesiyle yapılır. Buna 8 mg amonyum persülfat eklenir.
• %20 Akrilamid Çözeltisi: Bu çözelti, ml M Tris-HCl, pH , ml % akrilamid ve % bisakrilamidin 3 ml su içinde birleştirilmesiyle yapılır. Buna 8 mg amonyum persülfat eklenir.
• Fiksasyon Çözümü: Bu çözelti, %40 etanol, %10 asetik asit ve %50 su birleştirilerek yapılır.
• Protein Arıtma Solüsyonu: Bu çözelti, %20 etanol, %5 asetik asit, %75 su ve 4 mg ditiyotreitol karıştırılarak yapılır.
• Diğer Temel Reaktifler: % dikromat, % gümüş nitrat
• Karmaşık Oluşum Çözümü: Bu çözelti, % paraformaldehit ve %3 sodyum karbonatın birleştirilmesiyle yapılır.
• 1% asetik asit

Gümüş boyama prosedürü

Gümüş boyama, poliakrilamid jel elektroforezinde (SDS-PAGE) proteinleri görselleştirmek ve tespit etmek için kullanılan bir tekniktir. Bu yöntem, proteinleri ölçmek ve tanımlamak için moleküler biyolojide yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yazıda en önemli gümüş boyama protokollerinden ikisi olan SDS-PAGE ve Long Silver Nitrate Staining'i tartışacağız.

SDS-PAGE: Adım Adım Prosedür

1. Adım 1: Protein örneğini hazırlayın – 20 μL numune tamponuna 10 μg protein ekleyin ve ayırmadan önce oda sıcaklığında 60 dakika bekletin.
2. Adım 2: Akrilamid solüsyonunu yapın – Gradyan karıştırıcı kullanarak 8 ml'lik %3'lük akrilamid solüsyonu ve %20'lik akrilamid solüsyonunu doldurun. Çözeltiyi 5 ml/dk akış hızında bir cam küvete pompalayın.
3. 3. Adım: Protein örneklerini yükleyin – Bir izleme jeli, tercihen fenol kırmızısı kullanarak protein örneklerini jele yükleyin.
4. Adım 4: Jel elektroforezini çalıştırın – SDS-PAGE jelini 4 °C'de ve 15 mA elektroforez akımında çalıştırın.
5. Adım 5: Protein konsantrasyonunu hesaplayın – Sığır serum albümini kullanarak protein konsantrasyonunu hesaplayın.

Gümüş Boyama Prosedürü 2A:

1. Adım 1: Fiksasyon – Jeli sabitlemek için 30 dakika fiksasyon solüsyonu ekleyin.
2. Adım 2: Protein tedavisi – Jele 30 dakika boyunca bir protein işleme solüsyonu uygulayın.
3. 3. Adım: Dikromat ile durulayın– Jeli % dikromat ile 5 dakika durulayın.
4. Adım 4: Suyla yıkayın – Jeli 5 dakika su ile yıkayınız.
5. Adım 5: Gümüş nitrat ile dengeleyin – Jeli % gümüş nitrat ile 30 dakika dengeleyin.
6. Adım 6: Suyla yıkayın – Jeli 1 dakika su ile yıkayınız.
7. Adım 7: Karmaşık oluşum – Kompleks oluşturma solüsyonunu kullanarak jeli pH 12'de inkübe edin.
8. Adım 8: Karmaşık oluşumu durdurun – Kompleks oluşumunu durdurmak için %1 asetik asit ekleyin.
9. 9. Adım: Düzeltin ve görselleştirin – Gözlem ve/veya depolama için jelleri cam veya polyester levhalara sabitleyin.

Uzun Gümüş Nitrat Boyama Prosedürü 2B:

1. Adım 1: Fiksasyon – SDS-PAGE'den sonra jelleri %30 etanol ve %10 asetik asit içinde 60 dakika sabitleyin. Fiksasyon banyosunu yenileyin ve gece boyunca bırakın.
2. Adım 2: Jeli hassaslaştırın – 45 dakika boyunca bir tetratiyonat hassaslaştırma solüsyonu kullanarak jeli hassaslaştırın.
3. Adım 3: Etanol ile durulayın – Jeli %20 etanol ile iki parça halinde (iki kez), her yıkamada en az 10 dakika durulayın.
4. Adım 4: Suyla durulayın – Jeli her yıkamada 10 dakika olmak üzere dört kez suyla durulayın.
5. Adım 5: Gümüş nitrat ile emprenye edin – Jeli 12 mM gümüş nitrat ile emprenye edin.
6. 6. Adım: Bir geliştirici kutusunda düzenleyin – Gümüş nitrat emdirilmiş jelleri yarıya kadar su, bazik geliştirici ve durdurma solüsyonu (litre başına 40 g Tris ve 20 ml asetik asit) içeren bir kutuya yerleştirin.
7. Adım 7: Deiyonize su ile durulayın – Deiyonize su ile durulayın ve jeli çekin.

Gümüş boyama uygulamaları

• Bakteriyel ve Fungal Enfeksiyonların Tespiti: Gümüş boyama, çeşitli bakteri ve mantar enfeksiyonlarını saptamada etkili bir yöntemdir. Gümüş boyama kullanılarak saptanabilen en yaygın organizmalardan bazıları şunlardır: Pseudomonas aeruginosa, Treponema pallidum, Helicobacter pylori, Legionella, Leptospira, Bartonella, Pneumocystis, Candida, Histoplasma ve Cryptococcus.
• Proteinlerin Görselleştirilmesi: Gümüş boyama, proteinleri görselleştirmek için mükemmel bir araçtır. Bu teknik, proteinler arasındaki yapısal farklılıkları belirlemeye yardımcı olabilir ve bir numunedeki protein sayısını ölçmek için de kullanılabilir.
• Genomik Analiz: Gümüş boyama, numunelerden DNA ve RNA moleküllerini tespit edebildiği için genomik analiz için kullanılabilir. Bu, onu çeşitli organizmaların moleküler biyolojisini incelemek için değerli bir araç haline getirir.
• Bakteriyel Lipopolisakkaritlerin Tespiti: SDS-PAGE'de bakteriyel lipopolisakkaritleri tespit etmek için gümüş boyama kullanılabilir. Lipopolisakkaritler birçok bakteriyel enfeksiyonun patogenezinde anahtar rol oynadığından, bu bakteriyel enfeksiyonları teşhis etmek için önemli bir uygulamadır.
• Fungal Lipopolisakkaritlerin Tespiti: Gümüş boyama, Histoplasma karaciğer biyopsilerinde bulunanlar gibi mantar lipopolisakkaritlerini tespit etmek için de etkili bir araçtır. Bu, mantar enfeksiyonlarını teşhis etmek ve bu enfeksiyonların patogenezini anlamak için onu değerli bir araç haline getirir.

Sonuç olarak, gümüş boyama, tıbbi tanı ve analiz için çok yönlü ve güçlü bir tekniktir. Çeşitli bakteri, mantar ve moleküler bileşenleri algılama ve görselleştirme yeteneği, onu tıp biliminde önemli bir araç haline getirir.

Gümüş boyamanın avantajları

1. Yüksek hassasiyet: Gümüş boyama, bir numunedeki eser miktardaki proteinleri veya nükleik asitleri bile tespit edebilir.
2. Geniş dinamik alan: Gümüş boyama, çok çeşitli protein veya nükleik asit konsantrasyonlarını ölçebilir.
3. Farklı numune türleri ile uyumluluk: Gümüş boyama, dokular, hücre kültürleri ve jeller dahil olmak üzere çeşitli biyolojik örneklerle kullanılabilir.
4. Kullanım kolaylığı: Gümüş boyama, özel ekipman veya beceri gerektirmeyen basit, hızlı ve ucuz bir tekniktir.
5. Yüksek özgüllük: Gümüş boyama, boyutlarına, yüklerine ve şekillerine göre farklı proteinler veya nükleik asitler arasında ayrım yapabilir.
6. Diğer tekniklerle uyumluluk: Gümüş boyama, numune hakkında daha fazla bilgi sağlamak için jel elektroforezi gibi diğer tekniklerle birleştirilebilir.

Gümüş boyamanın dezavantajları

• Düşük özgüllük: Gümüş boyama, numunedeki diğer moleküllerin girişimi nedeniyle bazen spesifik olmayan boyama üretebilir.
• Sınırlı kantitatif doğruluk: Gümüş lekesinin yoğunluğu, numunede bulunan protein veya nükleik asit miktarıyla orantılıdır, ancak her zaman doğrudan orantılı değildir.
• Kirleticilerden kaynaklanan girişim: Numunedeki tuzlar veya deterjanlar gibi kirleticiler gümüş boyama reaksiyonunu engelleyebilir ve yanlış sonuçlara neden olabilir.
• Arkaplan gürültüsü: Arka plan boyaması yüksek olabilir ve düşük bolluğa sahip proteinlerin veya nükleik asitlerin saptanmasını engelleyebilir.
• Destain ihtiyacı: Görüntülemeden önce bağlanmamış gümüş iyonlarını uzaklaştırmak için gümüş lekesinin boyası çıkarılmalıdır, bu da bilgi kaybına neden olabilir.
• Zaman tükeniyor: Gümüş boyama işlemi zaman alıcıdır ve tamamlanması birkaç saat alabilir, bu da zamanın kritik bir faktör olduğu durumlarda bir dezavantaj olabilir.

Önlemler

• Gümüş lekesi derideki keratin proteinlerini tespit edebileceğinden jele çıplak elle dokunmayın.
• Denatüre etmek ve difüzyonu engellemek için boyamadan önce proteinleri düzeltin.
• Basit proteinler için fiksasyon için %80 metanol kullanılmalıdır.
• Gümüş emdirme süresi, jellerde renk oluşumu için çok önemlidir.
• Yeni yapılmış aldehit içeren tamponları kullanın.
• Jelleri hafifçe çalkalayarak cam bir kapta oda sıcaklığında boyama yapın.

FAQ

Referanslar

1. Hempelmann E, Krafts K. SDS poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılan proteinlerin gümüş boyama mekanizması. Biyoteknoloji Histokim. ;92(2) doi: / Epub 26 Şubat. PMID:
2. Kumar G. Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi ile Ayrılan Proteinlerin Gümüşle Lekelenmesi Prensibi ve Yöntemi. Yöntemler Mol Biol. ; doi: /_ PMID:
3. Chevallet M, Luche S, Rabilloud T. Poliakrilamid jellerde proteinlerin gümüşle boyanması. Nat Protokolü ;1(4) doi: /nprot PMID: ; PMCID: PMC
4. Hempelmann, Ernst & Krafts, K. (). SDS poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılan proteinlerin gümüşle lekelenme mekanizması. Biyoteknik ve Histokimya. /
5. seafoodplus.info
6. seafoodplus.info
7. seafoodplus.info
8. seafoodplus.info
9. seafoodplus.info?id=26&type=1
10. seafoodplus.info
11. seafoodplus.info#:~:text=Silver%20staining%20is%20the%20use,electrophoresis%3B%20and%20in%20polyacrylamide%20gels.