Drg Nedir

Duyusal sinir hücreleri hücre organlarının DRG içinde yer alır. Bu nöronlar sözde tek kutuplu ve periferik doku ve merkezi sinir sistemi innervate. Periferik sinir uçlarının duyusal nöronların kas, cilt, viseral organlar ve diğer dokularda. arasında kemik bulunur Onlar sinir uçlarının spinal dorsal boynuz ve sinyalleri sonra somatik duyu^1,2farklı artan yollar aracılığıyla beyne iletilir periferik hissi sinyalleri iletmek. Somatik duyu (yani, dokunmatik, ağrı ve ısı hissi) hissediyorum ve hareket ve mekansal oryantasyon (amac duyumları)^1,3algıladıkları vücut sağlar. Dört birincil afferent aksonlar da dahil olmak üzere, alt sınıflarını Grup ben proprioception iskelet kas, deri mechanoreceptors için yanıt Grup II (Aβ) lifler yanıt ve Grup III (Aδ) (Aα) lifler ve acıya yanıt Grup V (C) lifler ve sıcaklık. Diğer farklı derece myelinated sadece C lifleri unmyelinated, iken.

Nociceptors doku hasarı için potansiyel taşıyan zararlı uyaranlara (mekanik, termal ve kimyasal uyarımı) tarafından etkinleştirilen birincil duyusal sinir hücreleri vardır. Bu nöronlar myelinated Aδ lifleri ile unmyelinated C lifleri^1,4oluşur. Aδ lifleri sinir büyüme faktörü (NGF, trkA reseptör), CGRP ve SP. reseptörleri hızlı C lifleri peptidergic ve peptidergic C lifleri sınıflandırılır. Öte yandan, peptidergic C lifleri reseptörleri gliyal kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF, RET ve GFR reseptörleri), isolectin IB4 ve ATP-gated iyon Kanal alt türü (P2X3)^5,6,7için hızlı. Nociceptors iyon kanalları ifade tarafından seçkin ve nörotrofik faktör tarafından aktive,⁸sitokinler, nöropeptitler, ATP veya diğer kimyasal bileşikler. Stimülasyon, nörotransmiterler, CGRP, SP ve glutamat gibi spinal dorsal boynuz nosiseptif sinyalleri²iletimi için duyusal nöron terminallerinden serbest bırakmak. DRG sadece nöronlar oluşan değildir, aynı zamanda uydu Gliyal hücreler içerir. Uydu hücreleri duyusal sinir hücreleri çevreleyen ve mekanik ve metabolik destek^9,10sağlar. İlginçtir, DRG uydu Gliyal hücreler ağrı hissi¹¹düzenlenmesinde tutulabilir gösteren kanıt büyüyen bir gövdesi vardır.

Duyusal sinir hücreleri en sık kullanılan birincil nöronal hücre¹² ve Elektrofizyoloji, sinyal iletimi ve nörotransmitter yayın çalışmaları için kullanılan rapor. Bunlar da yaygın nöronal gelişim, enflamatuar ağrı, nöropatik ağrı, cilt hissi (gibi kaşıntı) ve akson akıbet^12,13,14,15hücresel mekanizmaları keşfetmek için kullanılır. DRG birincil kültürler deneysel bireylerde gerçekleştirilen çalışmalar gerçekleştirmek bilim adamları sağlayan biyokimyasal değişimler tek veya birden fazla hücre değerlendirmek için Disosiye nöronlar olarak kültürlü. Son zamanlarda, DRG başarıyla kültürlü insan organ bağış hangi büyük ölçüde translasyonel araştırma¹⁶yarar olabilir. DRG explants olarak Öte yandan, duyusal sinir hücreleri de kültürlü. DRG explants nöronlar Schwann hücreleri ve uydu gliyal hücrelerini de dahil olmak üzere, özgün doku mimarisini korumak ve nöronal ve nöronal olmayan hücreleri¹⁷arasındaki etkileşimler çalışma kullanışlıdır. DRG birincil kültürler içinde 2,5 h kolayca hazırlanabilir. Özellikleri ve hücre kompozisyon kaynağı DRG yüksek oranda yansıtıcı ve bu nedenle, belirli DRG (lomber veya torasik DRG) deneysel talepleri doğrultusunda toplanabilir. Embriyonik ve neonatal DRG nöronlar kültürleri NGF hayatta kalmak ve akson akıbet teşvik istemek, ama yetişkin nöronlar kültürleri medya^12,17Nörotrofik faktörler eklenmesi gerekmez. Ayrıca gibi deneysel hayvan kullanımı gerektirmeyen ND7/23 ve F11, piyasada bulunan DRG-Hibridoma hücre hatları vardır. Ancak, geçici reseptör potansiyel katyon eksikliği kanal Alt familya V üye 1 (TRPV1) ifade (küçük duyusal nosiseptif nöronlar için önemli bir işaretleyici) ve uyumsuz gen ifade profilleri sınırlamak onların uygulamaları¹⁸. Son zamanlarda, are lâyık ölümsüzleştirdi DRG nöronal hücre satırlarını fare (50B11)¹⁹ elde edilmiş ve fare (MED)²⁰, yüksek üretilen iş ekranları için çalışmalar hedefleme ilaç kullanın. Ancak, bu hücre satırları için profil oluşturma Gen ifadesinin henüz yapılması gerekiyor. Böylece, duyusal sinir hücreleri ölümsüzleştirdi bu hücrelere karşılaştırarak doğrulama deneyler devam etmektedir.

NPFFR2 DRG sentezlenmiş ve duyusal sinir terminallere spinal dorsal boynuz²¹translocated. Bu makalede, biz bel DRG hücre kültürü çalışmalarının ve onları nörotransmitter, CGRP ve SP. sürümü ikna etmek için NPFFR2 bir agonist ile tedavi için bir protokol sağlar NPFFR2 bağımlılığını daha fazla olan kültürlü DRG hücrelere transfected NPFFR2 küçük müdahale RNA (siRNA), kullanılarak test edilmiştir.

Deneysel hayvan kullanan burada açıklanan tüm yöntemleri kurumsal hayvan bakım ve kullanmak Komitesi (IACUC) Chang Gung Üniversitesi (CGU ) tarafından kabul edildi.

1. toplamak bel DRG deneysel fareler

1. 2 3 haftalık Sprague-Dawley (SD) fareler için bel DRG koleksiyon için kullanmak.
   Not: 4 haftadan sıçanlarından emir toplanan DRG nöronlar de burada açıklanan kültür koşullar altında büyümek değil.
2. Bir Otoklav içinde tüm cerrahi aletler sterilize.
3. Tiletamine ve zolazepam (20 mg/kg; mayi enjeksiyon (IP)) karışımı fareyle anestezi ve hayvan ayak-çekilme yanıt bir ayak parmağı-çimdik testinde gösterir kadar bekleyin.
   Not: Farklı anestezi stratejiler başarılı bir şekilde bu protokol için kullanılabilir.
4. Fareyi işten çıkarma tarafından ticari bir giyotin ile kurban.
5. Giyotin fareyi forelimb ve uyluk kemiği arasında vücut bagajında belirlemek için kullanın. Şekil 1A tahsil edilecek bölgenin bir diyagram için bkz.
   Not: Kaudal kesme hattı femur sadece rostral olmalıdır. Kesme Makinası spinal sütunda çok yüksekse eksize bel L6 DRG.
6. Göğüs kemiği kesmek ve tüm organları/doku diseksiyon makası ile (Şekil 2A-bir) kaldırın.
7. Fareyi dorsal parçası toplamak ve deri kaldırmak için bagajı kenarı boyunca kesin. Şekil 1B disseke dorsal gövde bir fotoğraf için bkz.
8. Buz üzerinde doku DRG toplama önce hazırlayın. Kürk ve eldiven kan temiz ve onları bir sonraki adıma devam etmeden önce % 75 etanol ile sterilize.
9. Lomber kapsayan kasları kaldırın. İlk olarak, omurga (sol ve sağ) kenarlarında iki kesim ve lomber rostral ölçüde işaretlemek için bir yan kesim yapmak. O zaman, sırt kasları omurga kemik kesme forseps (Şekil 2A-b) kaldırın.
10. Kemik kesme forseps ile vertebra sırt kısmını kaldırmak ve omuriliğe bulaşmasına neden.
11. Omurilik diseksiyon makası (Şekil 2A-c) ve forseps (Şekil 2A-d) kaldırın.
12. Lomber DRG omurga üzerinden son kaburga (torasik Vertebra 13) sayarak tanımlayın. Şekil 1 c bir vertebra pozisyonları için bkz: diyagramı.
13. Mikro-makas (Şekil 2A-f) ile ikili bel DRG (L1-L6) 2 mL buz gibi serum-Alerjik orta ile bir 35 mm Kültür çanak içine toplamak. DRG bağlanmasını nöronal lifleri ( Şekil 1 ciçinde belirtildiği gibi) kaldırın, sonra saflık kültürlerin geliştirmek için kültür çanak içine aktarmak.
    Not: Toplanan DRG orta yaklaşık 1 h için buz üzerinde tutulabilir. Bu arada, birden çok fareler DRG daha büyük bir havuzu oluşturmak için ötenazi.

2. birincil kültür sıçan kereste DRG

Not: Aşağıdaki adımları bir laminar akış mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor.

1. Kültür % 10 fetal Sığır serum, mM sodyum pyruvate ve 1 x penisilin/streptomisin 1 içeren orta hazırlamak DMEM-F12 x.
2. Kat hücre kültürü ile µg/mL poli-L-lizin için 2 h şey plaka sonra steril su ile yıkama tedavi.
3. 1 mL kültür orta kullanım için en az 30 dk önce 37 ° C CO₂ kuluçka ile kültür çanak önceden kuluçkaya.
4. DRG içeren 35 mm çanak laminer kukuIeta aktarmak ve DRG serum-Alerjik orta ile 3 kez pipet ile yıkayın.
   Not: Kapağın aktarmadan dış yemeğin % 75 etanol ile temizlenmelidir. 35 mm çanak DRG fareler (Bu deneysel tasarım taleplerine göre değişir) bir dizi içerebilir.
5. DRG hareket (tek bir sıçan gelen veya birden çok sıçanlarından emir kombine) yeni bir 35 mm Kültür çanak, hangi steril cımbızla (Şekil 2A-e) collagenase türü IA 2 mL (1 mg/mL serum-Alerjik orta) içerir.
   Not: Collagenase çözüm 0,22 µm şırınga filtreden geçirilerek sterilize.
6. 37 ° C CO₂ kuluçka için 30 dk collagenase çözümünde DRG sindirmek.
7. Collagenase çözümü kaldırmak ve yıkama DRG 3 kez 2 ml Hank'ın dengeli tuz solüsyonu (HBSS).
   Not: Artık lifler veya DRG çözüm içine gel dokuları olabilir. Onları pipet yıkama solüsyonu ile çıkarın.
8. 2 mL % tripsin-EDTA DRG içeren 35 mm çanak ve Özet DRG 37 ° C CO₂ kuluçka için 30 dk önceden ısınmış ekleyin.
9. DRG içeren çözüm 2 mL Cam Pipet tarafından 15 mL santrifüj tüpü aktarın.
   Not: Bu adımı bakımı ile gerçekleştirilmesi gereken bu yüzden DRG Cam Pipet sopa olabilir. Cam Pipet (yaklaşık mL) konik sonuna DRG içeren çözüm tutmak ve çözüm yavaş yavaş santrifüj tüpüne aktarma ancak duraklatma olmadan DRG kaybı önlenebilir.
10. Belgili tanımlık eriyik vasıl x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırın ve DRG resuspend için başka bir 2-mL serum-Alerjik orta ekleyin.
11. 2 kere ama değişiklik önceden ısıtılmış kültür ortamına serum-Alerjik orta son zamanında adımları yineleyin.
12. El ile yaklaşık 60 kez alev cilalı Pasteur pipet kullanarak DRG triturate (uzunluk mm ve ipucu baş iç çapı 1 mm). Bir fotoğraf için bir sigara cilalı pipet alev cilalı Pasteur pipet deliği karşılaştırma için 2B anlamaya görmek.
    Not: İç alev cilalı Pasteur pipet çapı yaklaşık % 10 kontrol pipet daha küçük ve konik sonuna içini daha yumuşak olmalıdır. Kabarcıklar hücreleri triturating zaman yaratmak değil dikkatli olun.
13. Poli-L-lizin-boyalı çanak CO₂ kuluçka kaldırın. Çanak inkübe kültür ortamından Aspire edin ve boyalı çanak üzerine Disosiye hücreleri temel olarak belirler.
14. Bir fare (ikili koleksiyonundan L1-L6, 12 toplam DRG için) DRG hücrelerden bir şey plaka dört kuyu tohum; şey plaka bir kuyuda yaklaşık 5 x 10⁴ hücreleri vardır.
    Not: Bu yoğunluk serbest CGRP veya SP tespiti için uygun ve immunostaining için de uygundur. Western blot ya da RNA çıkarma, bir fare (ikili L1-L6) DRG hücrelerden bir 6-şey plaka bir kuyunun içine tohum.
15. Eski yerine koymak ertesi gün 10 µM cytarabine (Ara-C) ilavesi ile kültür orta ve ng/mL NGF ve orta iki günde bundan sonra yenileyin.
    Not: torasik omurga toplanan olduysanız torasik DRG da aynı zamanda bu iletişim kuralı tarafından kültürlü.

3. transfection NPFFR2 siRNA DRG hücrelerdeki

1. NPFFR2 siRNA transfection gerçekleştirmek ve üreticinin iletişim kuralı göre siRNA kontrol.
   Not: Protokol seçilen transfection reaktif kullandığımız farklı ise adapte gerekir (bkz. Tablo malzeme).
2. Gün 3 hücre kaplama sonra orta mL önceden sıcak serum-Alerjik orta olarak değiştirin ve DRG 37 ° C CO₂ kuluçka 1 h için kuluçkaya.
3. 50 ekleyin (suda 1 µL RNase free) siRNA µL serum-Alerjik orta içine nM.
4. µL transfection reaktif 10 µL serum-Alerjik orta ekleyin.
5. Eriyik--dan adım ve pipet ve bu karışık transfection kuluçkaya tarafından çözüm oda sıcaklığında 10 dakika karıştırın.
6. Transfection çözüm bir DRG içeren şey plaka ve nazik sallayarak çözüm orta ile karıştırın.
   Not: birden fazla kuyu transfected gerekirse, aynı anda birden çok transfection çözümü dağıtılmalıdır.
7. DRG 37 ° C CO₂ kuluçka 6 h için kuluçkaya.
8. mL ekleyin / % 20 fetal Sığır serum, mM sodyum pyruvate ve 1 x penisilin/streptomisin 1'de kültür orta içeren DMEM-F12, 10 µM Ara-C ve ng/mL NGF, şey plaka içine ek x.
9. Başka bir 66 h (yenileme 48 h orta) için 37 ° C CO₂ kuluçka DRG kuluçkaya.

4. serbest bırakmak-in nörotransmitter birincil DRG hücrelerden

1. Gün 6 hücreler (72 h siRNA transfection sonra) kaplama sonra kültür orta µL serum-Alerjik orta olarak değiştirin ve 37 ° C CO₂ kuluçka 30 dk için hücreleri kuluçkaya.
2. 1 µL stimülasyon chemical(s) ve pipetting tarafından medya yavaşça karıştırın. 37 ° C CO₂ kuluçka çanak için belirlenen zaman kuluçkaya.
   Not: Bu makalede, kültürlü hücreleri için 1 h NPFFR2 agonist ile dNPA (funduszeue.info-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH₂, 5 nmol), teşvik.
3. Kültür orta kültür çanak ve 4 ° C'de askıya alınmış herhangi bir kirleri çıkarmak için 5 min için x g , santrifüj toplamak.
4. Süpernatant Santrifüjü toplamak ve gerektiği gibi fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), örnekleriyle sulandırmak. Enzim immunoassay (ÇED) kitleri ile nörotransmitter düzeylerini tahlil.
   Not: Supernatants sulandırılmış 1: CGRP düzeyini analiz daha önce buradaydı. Süpernatant SP. düzeyini analiz daha önce düşürülmüştü değil

5. CGRP ve SP ÇED

1. Hemen CGRP veya SP ÇED seti üreticisinin protokolüne göre örnekleri analiz.
   Not: Protokolü kullanılan seti bağlı olarak değişir.
2. CGRP ÇED kuyu seti içinde sağlanan yıkama arabelleği ile 5 kere yıkayın.
3. µL örnek µL anti-CGRP asetilkolinesteraz (AChE) kaydedici ve CGRP ÇED kuyu ekleyip 50 µL örnekler, 50 µL anti-SP ağrısı izleyici ve 50 µL anti-SP anti-serum SP ÇED kuyu içine ekleyin.
4. CGRP ve SP wells kitleri içinde sağlanan plastik film ile kapatın.
5. Gecede 4 ° C'de wells kuluçkaya
6. Wells CGRP ile 5 kere yıkamak veya SP arabellek yıkama ve kalıntı çözüm kuyulardan kaldırın.
7. µL Ellman'ın reaktif ilgili ÇED kitleri içinde sağlanan CGRP veya SP kuyu içine ekleyin.
8. CGRP wells, oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya ve SP kuyular için oda sıcaklığında 90 dk kuluçkaya. Her iki deneyleri için ışık kuyuları koruyun.
9. Plakayı dalga boyu nm, okumak ve sonuçlarına göre ilgili ÇED enstrüman hesaplayın.
   Not: kuyu dibinde el ile her zaman dokunmaktan kaçının ve temizlik bezleri Ellman'ın reaktif eklemeden önce objektif tarafından iyi alttan su lekeleri temizlemek.

Kültürlü bir şey tabak içinde sıçan bel DRG nöronlar gliyal hücre çoğalması etkisizleştirmek için ek Ara-C ve nöronal büyümeyi desteklemek üzere NGF kültür ortamında yetiştirilmiştir. Yaşam morfolojisi DRG hücreler görülmektedir. Şekil 3' te gösterildiği gibi tek bir nöron hücre gövdesi gün 1 bir tabak dibinde bağlı ve gözlem için seçili. Axon büyüme 1 – 3 gün takip. Gliyal hücreler çoğaltılamaz ve süreçleri duyusal nöron hücre gövdesi çevreleyen genişletilmiş. Başka bir kültür, CGRP protein nöronlar şeklinde ortaya çıkarmak için lekeli. Şekil 4' te, CGRP protein boyama sitoplazma ve akson duyusal nöronların görünür. Nükleer türleri morfoloji nöronlar ve Gliyal hücreler DAPI ile lekeli zaman farklıdır. Nöronlar Gliyal hücreler daha büyük ve daha yuvarlak çekirdeği var. Buna karşılık, glia çekirdekleri daha oval şekli (Şekil 4B) vardır.

Seçici NPFFR2 agonist, dNPA, CGRP ve SP. serbest bırakılması uyarmak için kullanılan Ayrıca, dNPA uyarılmış nörotransmitter yayın bağımlılığını NPFFR2 NPFFR2 siRNA ile transfecting hücreleri tarafından test edildi. NPFFR2 siRNA veya denetim siRNA birincil DRG hücreye agonist tedavisi önce 72 h transfected. DRG hücreleri için 1 h dNPA (5 nmol) ile tedavi edildi ve sürümü CGRP ve SP ayrı ÇED kitleri tarafından ölçüldü. DRG simülasyon dNPA ile CGRP ve SP düzeyi (Şekil 5A, B) medyada arttı. Ancak, yalnızca dNPA kaynaklı CGRP yayın NPFFR2 siRNA kültürlü DRG hücrelerdeki ifade tarafından inhibe. Şekil 5 ' te gösterilen sonuçları önceki bir yayından modifiye edildi ve burada izin²²ile kullanılır.

Şekil 1: doku işleme diyagramları. Lomber DRG 3 haftalık sıçanlarından emir toplanır. (A)nerede Giyotin kullanılması gereken hayvan kesmek için pozisyonlar noktalı çizgilerle gösterilir. (B) ile cilt dorsal gövde kaldırılmış ve (C) (L1-L6) üzerinden bel DRG konumlar gösterilir. INSERT DRG ve (Bu oklarla belirtilmiştir) bağlayan lifler temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: özel ekipman DRG birincil kültürler yalıtmak için gerekli.(A)cerrahi aletler DRG koleksiyonunda kullanılan. Soldan sağa: (bir) diseksiyon makası (büyük), (b) kemik kesme forseps, (c) diseksiyon makası (küçük), (d, e) noktası cımbız ve (f) mikro-makas. (B) A normal Pasteur pipet ve bir alev cilalı Pasteur pipet. "bir" iç gösterir düzenli Pasteur pipet ve "b" gösterir iç çapı alev cilalı Pasteur pipet. b / a ≒ 0,9. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: yaşam morfolojisi DRG hücreleri. Canlı DRG hücreleri mikroskobu tarafından takip. Hücreleri(a)gösterilen bir gün tohum tohum sonra iki gün (B) ve (C) tohum sonra üç gün sonra. Oklar, nöron gösterir ve ok uçları glia gösterir. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: kültürlü DRG hücrelerinin Immunostaining. DRG hücrelerin nöronlar ve 4', 6-diamidinophenylindole (DAPI) nöronlar ve Gliyal hücreler çekirdekleri için göstermek için anti-CGRP antikor ile immunostained vardı. (A) CGRP protein ifade duyusal nöron hücre organları ve akson lifleri. (B) çekirdekleri neurons ve glia DAPI ile lekeli. (C) birleştirilmiş resim--dan A ve B. ok gösterir bir nöron ve ok ucu gliyal hücreye gösterir. Ölçek çubuğu 30 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: kültürlü DRG hücreleri nörotransmitter sürümünden. Seçici NPFFR2 agonist, dNPA, CGRP ve SP sürümü DRG kültürlerden uyarmak için kullanıldı. Nörotransmitter yayın bağımlılığını NPFFR2 NPFFR2 siRNA ile transfecting hücreleri tarafından doğrulandı. (A ve B) sonra DRG hücreleri transfected NPFFR2 siRNA veya hedefleme-denetim siRNA (72 saat), dNPA (5 nmol) nin uygulanma CGRP sürümü ikna etmek 1 h ve SP. veri ortalama ± standart hata ortalamaya (SEM) ifade edilir ve t tarafından analiz edildi Wo-yönlü varyans analizi (ANOVA) Bonferroni özel mesaj ile sınar. p < 0,01, ***p < 0,; karşılık gelen araç kontrollere göre (N = 12 Grup başına). Paneller A ve B Lin ve ark. değiştirildi ²²Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Mevcut makalede, biz toplanması, enzim-ayrılma ve sıçan lomber kültürünü göstermek DRG. NGF Nörotrofik destek ile akson DRG nöron hücre tohum sonra 3 gün içinde genişletilmiş. Hücre için hücre soma sentezlenmiş ve akson lifleri taşınan CGRP protein lekeli sonra genişletilmiş aksonlar açıkça gözlemlenebilir. Uydu da genişletilmiş, hücrelerin nöronlar gün içinde çevrelemek bölen bu Gliyal hücreler izin süreçleri. Bu iletişim kuralı tarafından yetiştirilen birincil DRG hücreleri duyusal sinir hücreleri düzenleyen hücresel mekanizmaları soruşturmalar için uygundur. Burada, biz nöropeptitler, CGRP ve SP, kültürlü DRG nöronlar tarafından seçici bir NPFFR2 agonist dNPA üzerinden yayın teşvik. NPFFR2 soydaş reseptör NPFF için ve ağrı hissi ve düzenleme yolları^22,23' te katılmak için rapor. CGRP ve SP yayın NPFFR2 bağımlılığı daha da NPFFR2 siRNA kullanılarak doğrulandı.

DRG kültürler duyusal sinir hücreleri ve uydu Gliyal hücreler içerir. Uydu Gliyal hücreler nöronlar için metabolik destek sağlamak ve nöronal işlevleri^9,10sürdürmek. İmmunostaining resimler, onların çekirdekleri farklı şekillenir beri nöronlar ve gliyal hücrelerini tanımlamak kolaydır ( Şekil 4B' göster). Kültür çanak uydu hücrelerinde varlığı nöronlar belirli işlevi ve glia birbirinden ayırmak için deneysel bir talep ise sorunlu hale gelebilir. Örneğin, uydu hücreleri geliştirme ve bakım ağrı^11,24, söz konusu ve bazı çalışmalarda, sinir hücreleri ve Gliyal hücreler eylemleri DRG kültürler kullanarak ayırt etmek zor olacaktır inkar edilemez.

Bu protokol için ekstra dikkat gerektiren bir kaç kritik adımlar vardır. DRG toplanır bu yana laminer başlık dışında ilk olarak, ilave doku toplama işlemi sırasında hücre kirlenmesini önlemek için özen gösterilmelidir. Bir insan cerrahi odada gibi steril bir alan yaratmak gerek yok olması gerekiyordu ama enstrüman sterilizasyon ve temiz bir çalışma alanı gereklidir. Steril aletler sterilizasyon kese kullanılmadığı zaman tutmak ve herhangi bir gereksiz öğeleri dokunmaktan kaçınarak kirlenmesini önlemek için ipuçları içerir. Ayrıca, organizmalar kirletici sıçan vücut gövdede veya eldiven yapışabilir kürk üzerinde taşımış. Bu nedenle, kürk ve eldiven üzerinde kan izi % 75 etanol ile temizleyerek kaldırılmalıdır. Transfer organizmaların nefes veya tükürük önlemek için cerrahi maske takmak için operatör için de yararlıdır. Ayrıca, 35 mm çanak her zaman kapalı tutulması ve yerleştirme disseke DRG içinde yalnızca açılır gerekir. 35 mm çanak enzim sindirim önce yeni bir tabak değiştirmek önemlidir. Aşırı sindirim nöronlar hasar verebilir beri enzim sindirim sırasında kuluçka süresi uzatmak değil. Tripsin-EDTA 37 ° C için uygun sindirim verimliliği elde etmek için önceden ısıtmak emin olun. Verimliliği önemli ölçüde daha düşük sıcaklıklarda azalır ve DRG alev cilalı Pasteur pipet tarafından triturating zaman bir tek hücre süspansiyon elde etmek zor olacak. Pipet parlatma alev ağzının pürüzsüz ve keskin cam kenarına nöronlar yaralanmasına önlemek. Ancak, bir alev ile pipet aşırı ısınma iç yapar çapı çok küçük ve doku ya da hücre içeren çözüm geçmek zor olacak. Azaltılan bu çapı da büyük ölçüde DRG nöronlar collectable sayısını azaltarak toz aşamasında forma çok kabarcıklar neden olabilir. Son olarak, DRG kültürler işleneceğini hafifçe her zaman, özellikle orta veya performans gösteren ilaç tedavisi değiştirirken.

DRG nöronlar en sık kullanılan birincil kültürlü nöronal hücre¹²olduğu bildirilmiştir. Farklı çalışmalar, Elektrofizyoloji veya hücre biyoloji duyusal sinir hücreleri fizyolojik veya patolojik işlevlerini keşfetmek için arasında değişen çeşitli için yararlı olabilir. Büyük DRG birincil kültürler onlar yüksek üretilen iş tarama için uygun değildir kısıtlamasıdır. Tek bir fare DRG toplanan hücre sayısı sınırlı ve nöronlar kültüründe çoğaltmak mümkün değildir. Sınırlı hücre sayısı nedeniyle birden fazla DRG-Hibridoma hücre satır veya ölümsüzleştirdi DRG nöronal hücre hatları birincil kültürler^18,19,20değiştirmek için geliştirilmiştir. Ancak, protein ifade profilleri DRG hücre satır özgün DRG aynı olmayabilir ve bu nedenle her modeli sistem dikkatle doğrulanması gerekiyor. Laboratuar hücrelerde izole bir yana, fare embriyonik veya neonatal DRG nöronlar ticari olarak mevcut yapılmıştır. Bu nedenle, satınalma ticari kaynaklardan taze hazırlanmış DRG kültürler için bir alternatif olabilir.

DRG birincil kültürler uzun yıllar ağrı ile ilgili çalışmalarda çoğunlukla kabul edilen değerli deneysel bir araç olarak kullanılmaktadır. Bu modeli sistemi yakın gelecekte değiştirilmesi mümkün değildir. Kaliteli DRG nöronlar ile bilim adamları birçok alanda nörolojik eğitim yararına istikrarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edebilirsiniz.