Gümüş boyama, jellerdeki proteinlerin saptanması ve tanımlanması için kullanılan güçlü ve çok yönlü bir tekniktir. Bu teknik, gümüşü karboksil ve sülfhidril grupları gibi amino gruplarının kimyasal terminal veya yan zincirlerine bağlayarak gerçekleştirilir. Onlarca yıldır, poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak proteinleri ayırmak için gümüş boyama kullanılmıştır. Çekirdeklenme bölgeleri olarak bilinen proteinlerdeki küçük yarıklar, gümüş iyonlarının daha sonra kolaylıkla tespit edilebilen mikroskobik gümüş kristallerine indirgenmesini destekler.
Gümüş boyama, minimum arka plan gürültüsü ve kütle spektrometresinden azaltılmış parazit ile net görüntüler üreten, protein tespiti için oldukça hassas ve spesifik bir yöntemdir. Genel gümüş boyama işlemi, gümüşü sabitlemeyi, hassaslaştırmayı, gümüşle emprenye etmeyi ve bir görüntü geliştirmeyi içerir. Bu tekniğin çeşitli varyasyonları vardır; bazılarının tamamlanması yalnızca bir saat sürerken bazılarının tamamlanması 24 saatten fazla sürer. Tamamlandığında, leke birkaç hafta boyunca stabil kalabilir ve bu da uzun süreli gözleme izin verir.
Gümüş boyamanın tarihi, Fransız kimyager Louis-Emile Javal'ın sinir liflerini görselleştirmek için bir yöntem olarak tekniği ilk kez geliştirdiği yüzyılın sonlarına kadar uzanır. Bununla birlikte, tekniğin jellerdeki proteinlerin saptanmasında kullanılmak üzere uyarlanması yüzyılın başlarına kadar değildi. O zamandan beri, gümüş boyama, protein kimyasının temel unsuru haline geldi ve kan ve dokulardaki proteinlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli araştırma ve klinik uygulamalarda yaygın olarak kullanıldı.
Yıllar boyunca, gümüş boyama tekniği, hassasiyetini ve özgüllüğünü artırmak için çeşitli modifikasyonlar getirilerek rafine edilmiş ve geliştirilmiştir. Günümüzde gümüş boyama, protein kimyası alanında önemli bir araç olmaya devam ediyor ve biyolojik süreçler ve hastalık mekanizmalarının incelenmesinde çok önemli bir rol oynamaya devam ediyor. Daha yeni ve daha gelişmiş tekniklerin ortaya çıkmasına rağmen, gümüş boyama, güvenilirliği ve çok yönlülüğü nedeniyle yaygın olarak kullanılmaya devam ediyor ve bu da onu protein kimyagerlerinin araç setinin önemli bir parçası haline getiriyor.
Gümüş boyama, jellerdeki proteinleri görselleştirmek için kullanılan basit ama güçlü bir tekniktir. İşlem, çözünmeyen metalik gümüş oluşumuna yol açan, protein moleküllerinin çevresindeki gümüş iyonlarının seçici olarak indirgenmesini içerir. Gümüş emdirme aşaması, alkali protokol ve asidik protokol tarafından tanımlanan iki ana gümüş boyama protokolü vardır.
Alkali Protokolü: Gümüş Nitrattan Oluşan Bir Diamin Kompleksi – Alkali protokol, amonyum ve sodyum hidroksitten oluşan alkali bir ortamda gümüş nitrattan oluşan bir diamin kompleksi kullanır. Protein modelleri formaldehitin seyreltik asidik çözeltilerinde geliştirilir. Bu yöntem, ilgili proteinin asidik koşullara duyarlı olduğu uygulamalar için idealdir.
Asidik Protokol: Sudaki Gümüş Nitrat Çözeltisi – Buna karşılık, asidik protokol, jel emdirme için suda gümüş nitrat çözeltisi kullanır. Protein modelleri, amonyak ve sodyum hidroksitin alkalin ortamı altında formaldehit solüsyonunda geliştirilir. Bu yöntem, ilgili proteinin alkali koşullara duyarlı olduğu uygulamalar için tercih edilir.
Başarılı Gümüş Boyama Adımları Gümüş boyama işlemi, fiksasyon, jel işlemi, gümüş emdirme ve jel durulama dahil olmak üzere dört ana aşamaya ayrılabilir.
Sonuç olarak, gümüş boyama, gümüş emdirme aşaması tarafından tanımlanan iki ana protokol ile jellerdeki proteinleri görselleştirmek için güçlü bir tekniktir. Alkali veya asidik protokolü seçin, en küçük protein miktarlarını bile tespit etme yeteneği ile çarpıcı sonuçlar bekleyebilirsiniz.
Gümüş boyama, 'lerin başına kadar uzanan bir geçmişe sahip, jellerdeki proteinleri görselleştirmek için kullanılan güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, gümüş lekesinin de onu benzersiz bir madde yapan bazı ilginç fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip olduğunu biliyor muydunuz? Bu bölümde, gümüş lekesinin özelliklerine ve onu laboratuvarda değerli bir alet yapan şeyin ne olduğuna daha yakından bakacağız.
Sonuç olarak, gümüş lekesi, jellerdeki proteinleri görselleştirmek için çok yönlü ve değerli bir araçtır. En küçük protein miktarlarını bile tespit etme kabiliyetine ek olarak, gümüş lekesi ayrıca kaynama noktası, erime noktası, buharlaşma ısısı, yoğunluk ve molar ısı kapasitesi dahil olmak üzere bir dizi ilginç fiziksel ve kimyasal özelliğe sahiptir. Bu özellikleri anlamak, laboratuvar deneylerinizde gümüş lekesinden en iyi şekilde yararlanmanıza yardımcı olabilir.
Gümüş boyama, poliakrilamid jel elektroforezinde (SDS-PAGE) proteinleri görselleştirmek ve tespit etmek için kullanılan bir tekniktir. Bu yöntem, proteinleri ölçmek ve tanımlamak için moleküler biyolojide yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yazıda en önemli gümüş boyama protokollerinden ikisi olan SDS-PAGE ve Long Silver Nitrate Staining'i tartışacağız.
Sonuç olarak, gümüş boyama, tıbbi tanı ve analiz için çok yönlü ve güçlü bir tekniktir. Çeşitli bakteri, mantar ve moleküler bileşenleri algılama ve görselleştirme yeteneği, onu tıp biliminde önemli bir araç haline getirir.
Gümüş boyama, jel elektroforezinde olduğu gibi bir numunedeki proteinleri veya nükleik asitleri görselleştirmek ve ölçmek için kullanılan bir yöntemdir.
Gümüş boyama, gümüş iyonlarını numunedeki proteinlere veya nükleik asitlere bağlayarak çalışır ve bunlar daha sonra karanlık bir bant olarak görselleştirilebilen bir çökelti oluşturur.
Gümüş boyama, bir numunedeki proteinlerin veya nükleik asitlerin varlığını görselleştirebildiği ve konsantrasyonlarının yarı niceliksel bir tahminini sağlayabildiği için hem niteliksel hem de niceliksel bir tekniktir.
Gümüş boyamanın hassasiyeti yüksektir ve bir numunede eser miktarda protein veya nükleik asitleri bile tespit edebilir.
Gümüş boyamanın dinamik aralığı geniştir ve çok çeşitli protein veya nükleik asit konsantrasyonlarını ölçebilir.
Gümüş boyamanın avantajları arasında yüksek hassasiyet, geniş dinamik aralık, farklı numune türleri ile uyumluluk, kullanım kolaylığı, yüksek özgüllük ve diğer tekniklerle uyumluluk sayılabilir.
Gümüş boyamanın dezavantajları arasında düşük özgüllük, sınırlı kantitatif doğruluk, kirleticilerden kaynaklanan girişim, yüksek arka plan gürültüsü, leke çıkarma ihtiyacı ve zaman alıcı yer alır.
Evet, gümüş boyama, numune hakkında daha fazla bilgi sağlamak için jel elektroforezi gibi diğer tekniklerle birleştirilebilir.
Görüntülemeden önce bağlanmamış gümüş iyonlarını uzaklaştırmak için numunenin bir su veya etanol solüsyonu ile yıkanmasıyla gümüş lekesi genellikle temizlenir.
Gümüş boyama, biyokimya ve moleküler biyoloji alanında yaygın olarak kullanılan ve köklü bir tekniktir.
Altın ve gümüş tuzlarının kullanıldığı yüzlerce teknik vardır. Bu teknikleri ilk kez Ramon y Cajal kullanmıştır. Camillo Golgi () ve Santiago Ramon y Cajal () ın geliştirdikleri teknikler önem taşır. Bu araştırıcılar sinir doku gösterimi üzerine çalışmalarından dolayı Nobel ödülünü paylaşmışlardır. Bu yöntemler özellikle glial elementlerin gösterimi için uygundur. Her iki araştırıcı da sinir sistemi çalışmaları için bilimde çok önemli yer tutar. Golgi günümüzde hala sinir hücreleri ve fibrilleri için çok kullanılan birçok boya geliştirmiştir. Tekniğinde aldehit-osmiyum-dikromat çözeltisini fiksatif olarak kullanmıştır. Ardından gümüş tuzları ile impegne etmiştir. Perikaryonlar altın rengi uzantıları siyah olarak gösterilebilir. Nöral dokuların şekillerini ve bağlantılarını ortaya koymuşlardır. Gümüşleme ile nöronlar ve glial hücreler gösterilebilir. Ramon y Cajal tekniğinde gümüş çöktürüldüğünde nöronlar sarı/turuncu renkte, nörofibriller kahverengi-siyah arası, nöroglialar ise siyah olur. Gümüşlemede sadece nöroglialar siyahlaşır.
Metalik çöktürme teknikleri, sinir hücre uzantıları ve retiküler fibrillerin gösteriminde standart bir yöntemdir. Metalik çöktürme ile gösterim, dokulardaki indirgeyici ajanlar yeterli güçte ise tek basamaklı bir tekniktir. Fakat fibrillerin çöktürme ile gösteriminde argirofil hücrelere benzer olarak genellikle 2 basamaklı indirgenme olur. Gümüş yerine altın da kullanılabilir.
Bazı metalik bileşikler dokular tarafından opak, genellikle siyah birikinti oluşturarak metalik duruma indirgenebilirler. Kolayca indirgendiğinden ve depo edilmiş gümüş stabil olduğundan Ag(NH3)2OH çözeltileri histoloji için çok uygundur. Melanin gibi tirozin türevleri ve intestinal bezlerin Kultschitzky hücrelerinde bulunan fenolik bileşikler Ag(NH3)2OH’ ı görülebilen birikim oluşturarak indirgerler. Bu tip hücreler arjentaffin hücreler olarak bilinir. Ag(NH3)2OH’ı direkt olarak indirgeyemeyen fakat dışarıdan eklenen bir indirgeyici ajanla gerçekleştiren hücreler argirofil hücreler olarak bilinir.
1-Golgi Teknikleri: Golgi çöktürmeler boya değildir. Bu teknikle tüm hücre gövdesi ve dendritler izlenebilir. Miyelinli aksonlar tuzları biriktirmezler. Miyelinsiz yapılar olan terminal son düğmecikler tuzlarla dolabilir. Uzun (bazıları birkaç ay) ve karmaşık yöntemlerdir. Sinir hücre ve uzantılarını dens siyah bir impregnasyonla gösterirler. Hücre iç yapısı kararırken, aksonlar ise genellikle sadece miyelin tabakası olmadığında impregne olurlar. Golgi' nin 3 yöntemi bilinmektedir. Hızlı, yavaş ve karışık olmak üzere
Yavaş Teknik:Küçük organ parçaları Müller çözeltisine veya % kaliumbikromat çözeltisine atılır. Karanlıkta veya kahverengi bir şişe içerisinde hafta saklanır. Bu süre sonunda deneme için bir parça alınır. Süzgeç kağıdı ile kurutularak % 0,75 ‘lik gümüş nitrat çözeltisinde 24 saat bırakılır. Hafifçe bistüri ile çok ince bir kaç kesit lama alınır, mikroskopta bakılır. Gümüş empregnasyonu (çökme) görülmezse kaliumbikromat çözeltisine bırakılır. Görülürse % 40’ lık alkol içerisinde yıkanır ( saatte bir alkol yenilenir). Ardından % 80 ve % 90'lık alkollerden geçirilir. Absolu alkolde 12 saat bırakıldıktan sonra yarı yarıya eter- alkol çözeltisine aktarılır.
1 gün % 2 celloidin
1 gün % 4 celloidin
1 gün % 8 celloidin
% 8 celloidin ile bloklanır. Bloklar %96’ lık alkolde saklanır. Alınan kesitler yine % 96’ lık etil alkol içine alınarak ardından absolu alkolden geçirilir. Karbolksild konarak kapatılır.
Hızlı Teknik:Çok ince ve taze parçalar tercih edilir.
Golgi Çözeltisi
% 1’lik osmiyum acid 10cc
% 2,5 -3,5 kalium bikromat 40cc
mm kalınlığındaki mm genişliğindeki doku parçaları dibinde cam boncuk bulunan kahverengi şişe içindeki Golgi çözeltisine aktarılır. 50 cc’lik Golgi çözeltisine bu büyüklükteki 6 parça konabilir. Parçaların çözelti içinde ne kadar kalacağı önceden söylenemez. Süre parçaya göre değişir. Onun için aynı yerlerden birkaç parça alıp atmalı ve zaman zaman ( güne kadar) parçalar çıkarılarak papier buharla kurutulmalıdır. Parçalar % ’ lik gümüş nitrat çözeltisine aktarılırak gün bırakılır ( 48 saat ). Çözelti sararırsa veya bulanırsa yenilenmesi gerekir. % 40’ lık etil alkol içinde saat yıkanır. Alkol sık sık yenilenmelidir. % 80–90 ve absolü alkollerden geçirilerek yarı yarıya eter-alkol eriyiğinde 1 gün ; % 2’ lik celloidinde 1 gün, % 4’lik celloidinde 1 gün bırakılır. % 8’lik celloidinde saklanır. Kesitler alınarak %96’lık etil alkol içine alınır. Ardından absolü alkolden geçirilerek karboliksilde konur kapatılır.
Burada, biz yeni bir floresan polyacrylamide jellerin toplam protein algılaması için teknik boyama özetleyen bir detaylı iletişim kuralı tanımlamak. Ag+algılar bir gümüş iyon özgü Floresans tahrik sonda protokol kullanır-protein kompleksleri ve geleneksel chromogenic gümüş lekeler belirli sınırlamaları ortadan kaldırır.
Gümüş boyama polyacrylamide Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) takip jelleri bantlarında protein görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir Renkölçer tekniktir. Klasik gümüş lekeleri yüksek arka plan boyama, zavallı protein kurtarma, düşük tekrarlanabilirlik, miktar ve kütle spektrometresi (MS) ile sınırlı uyumluluk için dar bir doğrusal Dinamik Aralık gibi bazı dezavantajları var. Şimdi, bir fluorogenic Ag+ sonda, TPE-4TA, kullanımı ile floresan bir gümüş boyama yöntemi polyacrylamide jellerin toplam protein görselleştirme için geliştirdik. Bu yeni leke geleneksel gümüş lekeleri zahmetli gümüş azaltma adımda önler. Ayrıca, floresan gümüş leke iyi tekrarlanabilirlik, ışık hassasiyeti ve protein bulunması, yapım o bir yararlı ve pratik protein jel leke doğrusal miktar gösterilmektedir.
Birçok boyama yöntemi Jel Elektroforez takip, örneğin Coomassie parlak mavi, gümüş leke, Floresans gibi Renkölçer boya kullanarak proteinler görselleştirmek için kullanılan veya radyoaktif1,2, etiketleme olmuştur 3,4. gümüş boyama olarak kabul edilir en hassas teknikleri için basit ve ucuz reaktifler gerektiren protein algılama biri olmak. İki büyük aile sınıflandırılabilir:5,6ammoniacal gümüş leke ve gümüş nitrat leke. Alkali ammoniacal gümüş yönteminde, gümüş-diamin karmaşık amonyak ve sodyum hidroksit ile üretilen ve metalik gümüşe asidik formaldehit çözümünü kullanarak geliştirme sırasında düşük. Leke temel proteinler için verimli bir şekilde karşılar ama asidik ve tarafsız proteinler için güvenliği aşılan bir performansı gösterir ve ayrıca, klasik glisin ve taurin elektroforetik sistemleri için sınırlı olduğunu. Buna karşılık, gümüş nitrat lekeleri yüksek biyo-benzeşme protein gümüş iyonların yararlanmak, öncelikle sulfhydryl ve karboksil grupları yan zincirlerinden ve asidik protein daha verimli bir şekilde leke eğilimi7. Bağlama gümüş iyonu sonra (genellikle formaldehit ve sodyum tiyosülfat içeren metal karbonat çözeltisi imal) gelişmekte olan bir çözüm görselleştirmek için bir kahverengi koyu rengi inşa Metalik Gümüş tahıl için gümüş iyonları azaltmak için uygulanır protein bantları.
Gümüş boyama gelişimi 'li yıllarda8beri onun çok yönlü ve yüksek hassasiyet için bilinen olmasına rağmen yöntem sık kadar zor kabul edilir. Gümüş boyama yöntemleri zaman sınırlı adımlar ve düşük tekrarlanabilirlik göster. Gümüş leke rengi genellikle tek tip ve kontrol etmek zordur, azaltma adım bağımlı olmadığından gümüş leke nicel bir yöntem değildir ve böylece, jel karşılaştırma çalışma ve protein miktar9için tavsiye edilmez. Duyarlılık içinde en iyi duruma getirilmiş yöntemleri de10boyama daha fazla üniforma sağlayabilir aldehitler yararlanmak olabilir. Ancak, daha fazla akış aşağı analiz protein aldehitler tarafından polietilenin nedeniyle pahasına bu. Hızlı iletişim kuralları çoğunlukla birleştirmek ya da uzlaşma tekrarlanabilirlik ve leke5tekdüzelik süresini kısaltmak için adımları kısaltabilirsiniz. Sonuç olarak, orada çok sayıda gümüş türevleri içinde protein jel, her belirli gereksinimleri uyacak şekilde en iyi duruma getirilmiş boyama boyama; Örneğin, basitlik, duyarlılık veya peptid kurtarma oranı için aşağı akım analizi. Bu öznitelikler de birbirlerine bir etkiye sahip ve bir iletişim kuralı tüm gereksinimlerinin karşılanması zor olabilir.
Bu çalışmada, biz yeni bir floresan gümüş boyama yöntemi polyacrylamide jel protein algılama için tanıtmak. Bu yöntemde, bir fluorogenic sonda gümüş iyonları, TPE-4TA (şekil 1), gümüş emdirilmiş proteinler11görselleştirmek için kullanıyoruz. TPE-4TA toplama kaynaklı emisyon (AIE) ilke tarafından tasarlanmıştır. Bu sigara-sulu çözüm içinde çözünmüş zaman yayıcı ama gümüş iyonlarının varlığında son derece yayıcı. Geleneksel gümüş lekeleri chromogenic geliştirilmesinde adım gelişen bir fluorogenic ile değiştirerek, floresan gümüş yöntemi azaltılmış bir arka plan ile toplam proteinlerin sağlam boyama sağlar.
Ayrıca, floresan gümüş leke için yaygın olarak kullanılan SYPRO Ruby leke ile karşılaştırılabilir ve geleneksel gümüş lekeleri ile ulaşılabilir protein miktar iyi dinamik bir doğrusal Aralık gösterdi. Jel bir ultraviyole lamba ile sık kullanılan jel dokümantasyon sistemleri üzerinde yansıma (uyarma dalga boyu: / nm kanal; emisyon: ~ nm) birçok biyolojik laboratuarlarında.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
1. hazırlık jel
Not: Gösteri jel sonra kısa bir süre12SDS-sayfa boyama için hazırlamak için standart bir protokol izler. Kısaca, aşağıdaki adımları örnekleri hazırlanması tarif ve Elektroforez jel.
2. jel fiksasyonu
3. hazırlık AgNO3Çözüm ve jel gümüş emprenye
4. Fluorogenic geliştirme jel
5. destaining ve görüntüleme
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Tarafından floresan gümüş leke lekeli protein bantları nm UV lambası altında yoğun bir yeşil Floresans sergi. Bütün 14 protein grupları ( kDa), yukarıdan aşağıya doğru açıkça görülebilir, iyi tarafından SYPRO Ruby boya (Şekil 2)10lekeli 14 kırmızı renkli olanlar ile birleştiriliyor.
İle ilgili nicel protein algılama, jelleri görüntüleme sistemi otomatik yordamları kullanarak bir jel tarafından görüntüsü ve görüntü analiz edildi ve ticari yazılım kullanarak karşılaştırıldığında. Boyama yöntemi bu floresan gümüş yüksek çözünürlüğe sahip görünüyor. Bazı protein grup için floresan gümüş leke duyarlılığını da biraz floresan SYPRO Ruby leke daha iyi. Özellikle, floresan gümüş leke performansını yeni yöntemi proteinler düşük molekül ağırlıkları ile tespiti için özellikle yararlı olduğunu belirten ~ kDa protein grupları için geliştirilmiş. Verileri de floresan gümüş leke nispeten geniş bir aralığında protein miktar (şekil 3)11için iyi ve düzgün doğrusallık tüm 14 proteinler için verdi öneririz.
Arka plan sinyal ve çarpık zirveleri yüksek düzeyde verdi gümüş nitrat leke aksine floresan gümüş leke gruplar iyi kontrast ve Tekdüzen yoğunluğu dağıtım SYPRO Ruby leke karşılaştırılabilir ile tüm 14 proteinler arasında tespit (Şekil 3).
Jel fiksasyon (şekil 4) Boyama yüksek arka planda neden olur sonra bu yetersiz yıkama unutmayın. Artık Asetik asit TPE-4PA kadar hafif ve güçlü bir arka plan için yol.
Resim 1: TPE-4TA ve onun algılama mekanizması AG+kimyasal yapısı. X = H veya Na+. Önceki işten, telif hakkı WILEY-VCH11uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: floresan gümüş boyama.A) iletişim kuralı Özet. B) jeller floresan gümüş leke (solda) ve SYPRO Ruby leke (sağ) tarafından lekeli karşılaştırılması nm ışınlama altında el bir UV lamba ile paralel görüntüsü. Proteinler ( kDa) tarafından iki kat seri seyreltme ng/gruptan başlayarak en sol şeritte doluydu. Önceki işten, telif hakkı WILEY-VCH11uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: floresan yoğunluğu protein miktarı, temsilcisi jel görüntüleri ve sinyal profillerden (beşinci lane) üç farklı lekeleri ile jelleri, karşı proteinlerin.(A)gümüş nitrat leke tutmayan,()B) floresan gümüş leke ( nm uyarma) ve (C) SYPRO Ruby leke. Rakamın ilk sütun (soldan başlayarak) ilk lane için normalleştirilmiş protein miktarı karşı 14 proteinlerin ( kDa) her grup için leke yoğunluğu gösterir. İkinci sütun karşılık gelen leke temsilcisi jel görüntüleri gösterir. Jel yüklenen protein miktarı Şekil 2' de anlatılan. Önceki işten, telif hakkı WILEY-VCH11uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: jel suboptimal deneme lekeli. Bu deneyde, çamaşır fiksasyon adımdan sonra yetersiz. Artık Asetik asit TPE-4TA toplama indüklenen ve güçlü bir arka plan neden oldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Burada sunulan bir roman floresan gümüş yöntemi polyacrylamide jeller proteinler için boyama. Bu strateji geleneksel gümüş lekeleri ve floresan lekeleri bütünleştirir. Proteinlere olduğu gibi diğer gümüş gümüş iyonu seçmeli bağlama lekeleri ama son derece hassas fluorogenic gümüş kullanır boyama patlatır gümüş ilişkili proteinler kadar ışık için TPE-4TA sonda. Fluorogenic sonda TPE-4TA oldukça düşük konsantrasyon nanomolar Aralık11, gümüş iyonları hissi olabilir bu yana, bir indirgeyici görselleştirme adım geleneksel gerektiği gibi daha fazla talep olmadan son derece hassas bir algılama sağlar Gümüş lekeleri. Bu koş koş varyasyonları en aza indirmek olacaktır. Bu arada, o sert kimyasallar, formaldehit ve oxazolidin, peptid kimlik MS analizde sık sık müdahale gibi kullanımını önler. Ayrıca, TPE-4TA AIE-aktif ve ücretsiz olarak kendi kendine su verme herhangi bir sorun, bir protein grubu, yoğun birikmiş boyalar topluca yanıt boya molekülleri sayısına yayarlar olabilir. Bu bir geniş doğrusal Dinamik Aralık (LDR) protein algılama ve SYPRO Ruby leke ile karşılaştırıldığında çok daha parlak bir boyama için katkıda bulunur.
Geleneksel gümüş boyama ile karşılaştırıldığında, daha az miktarda gümüş nitrat bu yeni tekniği-özellikle boyama için gereklidir, %0, %0,1 yaygın olarak bildirilen gümüş nitrat protokolleri4boyama kullanılan. Bu yeni leke başarısı tamamen aşağı bir yüksek karşıtlık arka plan karşı inanılmaz derecede parlak ve hassas floresan soruşturması birleşimi olduğunu onaylanmadığına karar. Buna karşılık, daha yüksek bir miktar gümüş özellikle yüksek arka planı ortaya çıktığında karanlık görünür bantları, üretmek için azaltma geleneksel gümüş lekeleri gelişmekte olan adımı gerektirir. Bu yöntemde, fluorogenic geliştirme zamanı geleneksel kimyasal geliştirme uzundur; Ancak, bu bir sınırlama olarak veya bir avantaj olarak tartışılabilir. Jel gelişmekte olan çözümde sonuçları operatörden alınabilir alt çeşitlerini sonucunda, uzun bir süre için bırakılabilir. Sadece daha az sayıda adımla gerekmez, ancak aynı zamanda, daha fazla duraklar, bu iletişim kuralını oldukça uygun kılan alınabilir vardır. İçinde karanlık bir arka planda kaynaklanan jel, overdevelop geleneksel gelişmekte olan adım farklı olarak overstaining hiçbir risk yok. Ek protein örnekleri daha fazla bir şekilde değerlendirilmesi (şekil 3) garanti olsa bu floresan gümüş leke da daha küçük bir interprotein değişim bekleniyor.
Önerilen gümüş nitrat konsantrasyonu protokolü takip etmek önemlidir; daha yüksek bir konsantrasyon kullanarak daha iyi performans ve duyarlılık yol açmaz ama, bunun yerine, Floresans gruplarından yutmak bir güçlü arka plan Floresans üretir. Sorun giderme açısından, duyarlılık ve parlaklık kaybına aşırı çamaşır yıkama adım fluorogenic geliştirme önce veya yetersiz gümüş emprenye neden olabilir. Bu yöntem için protein grup Floresans sinyalinin Floresan TPE-4TA-Ag+ karmaşık oluşumu için gerekli olan protein bağlı gümüş iyonları, sayısına bağlıdır. Protein bu boyama yöntemi potansiyelini en üst düzeye çıkarmak için gümüş iyonları ile doymuş.
Son olarak, daha önce fluorogenic boya Bu yöntemde kullanılan gümüş iyonu için belirtildiği gibi TPE-4TA, pH hassas da. Düşük pH protonate bir yüksek arka plan leke kaynaklanan jel bulabilsem için ücretsiz TPE-4TA olabilir. Bu nedenle, artık Asetik asit fiksasyon çözümden bırakın, yanlış yıkama adımları leke kalitesi büyük ölçüde etkiler. Jel fluorogenic geliştirme adım (şekil 4) nispeten nötr pH tutmak önemlidir. Ayrıca TPE-4TA çözüm pH boyama önce ayarlamak yararlı olabilir. Bu boya yakın gelecekte ticari bekleniyor.
Özetle, biz roman floresan gümüş leke SDS-sayfa jel toplam proteinlerin görselleştirme için pratik bir protokol nitelendirdi. Boyama basit, kullanımı kolay, maliyet-etkin ve iyi boyama bir performans sunuyor. Bu yöntem büyük ölçüde jelleri protein bantlarında tanımlamasını kolaylaştırabilir ve protein analizi için yararlı bir araç sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Bu floresan gümüş boyama üzerinde bir patent başvurusu şikayetçi oldu.
Yazarlar Patrick Chan Ming Wai Lau merkezinde onarıcı tıp, Karolinska Institutet, onun teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. S. X. İsveçli Araştırma Konseyi (Grant No ) destek için minnettar olduğunu.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Fisher Scientific | NP | Reagent |
% Bis-Tris Protein Gels, mm, well | Thermo Fisher Scientific | NPBOX | Precast gel |
Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP | Reagent |
MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP | Reagent |
Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A | Equipment |
W Power Supply ( VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS | Equipment |
Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | Sample | |
Silver nitrate | Sigma-Aldrich | G-R | Reagent |
Ethanol | Bragg and co. | J | Reagent |
Acetic acid | J.T. Baker | A | Reagent |
Milli-Q Synthesis A10 | Merk | - | Provides MΩ.cm water |
gel documentation system (c model) | Azure biosystems | - | Equipment |
DOWNLOAD MATERIALS LIST
çamaşır makinesi ses çıkarması topuz modelleri kapalı huawei hoparlör cızırtı hususi otomobil fiat doblo kurbağalıdere parkı ecele sitem melih gokcek jelibon 9 sınıf 2 dönem 2 yazılı almanca 150 rakı fiyatı 2020 parkour 2d en iyi uçlu kalem markası hangisi doğduğun gün ayın görüntüsü hey ram vasundhara das istanbul anadolu 20 icra dairesi iletişim silifke anamur otobüs grinin 50 tonu türkçe altyazılı bir peri masalı 6. bölüm izle sarayönü imsakiye hamile birinin ruyada bebek emzirdigini gormek eşkiya dünyaya hükümdar olmaz 29 bölüm atv emirgan sahili bordo bereli vs sat akbulut inşaat pendik satılık daire atlas park avm mağazalar bursa erenler hava durumu galleria avm kuaför bandırma edirne arası kaç km prof dr ali akyüz kimdir venom zehirli öfke türkçe dublaj izle 2018 indir a101 cafex kahve beyazlatıcı rize 3 asliye hukuk mahkemesi münazara hakkında bilgi 120 milyon doz diyanet mahrem açıklaması honda cr v modifiye aksesuarları ören örtur evleri iyi akşamlar elle abiye ayakkabı ekmek paparası nasıl yapılır tekirdağ çerkezköy 3 zırhlı tugay dört elle sarılmak anlamı sarayhan çiftehan otel bolu ocakbaşı iletişim kumaş ne ile yapışır başak kar maydonoz destesiyem mp3 indir eklips 3 in 1 fırça seti prof cüneyt özek istanbul kütahya yol güzergahı aski memnu soundtrack selçuk psikoloji taban puanları senfonilerle ilahiler adana mut otobüs gülben ergen hürrem rüyada sakız görmek diyanet pupui petek dinçöz mat ruj tenvin harfleri istanbul kocaeli haritası kolay starbucks kurabiyesi 10 sınıf polinom test pdf arçelik tezgah üstü su arıtma cihazı fiyatları şafi mezhebi cuma namazı nasıl kılınır ruhsal bozukluk için dua pvc iç kapı fiyatları işcep kartsız para çekme vga scart çevirici duyarsızlık sözleri samsung whatsapp konuşarak yazma palio şanzıman arızası