Hek293 Nedir

Özet

G proteinlerine kenetli reseptörler (GPKR'ler), hücre dışı sinyallerin hücre içine iletilmesini sağlayan hücre yüzeyi reseptörlerinin en büyük ailesidir. Terapötik amaçla kullanılmakta olan ilaçların % 50'den fazlasının hedefi olmaları ve yeni ilaç keşfi çalışmaları için hala birer potansiyel hedef olarak görülmeleri nedeniyle, bu reseptörlerle sinyal iletim mekanizmalarının incelenmesi güncelliğini korumaktadır. Bu alanda özellikle son on yıla ait bulgular, klasik bilgi birikimine farklı açıdan bakmayı zorunlu kılmış ve yeni kavramların doğuşuna zemin hazırlamıştır. GPKR'lerle sinyal iletimine dair bu yeni kavramlardan biri ?Ligandların Fonksiyonel Seçiciliği? kavramıdır. Bu kavram, genel bir ifadeyle ?ligandların aynı reseptörle uyarılan farklı sinyal yollarını farklı efikasilerle uyarabilme yeteneği? olarak tanıfunduszeue.info çalışma kapsamında fonksiyonel seçicilik kavramı bir GPKR olan ß2-AR (Beta2-Adrenerjik Reseptör) üzerinden ele alınmıştır. Heterolog olarak ß2-AR eksprese eden HEK kültür hücrelerinde ß2-AR ligandlarının cAMP ve ERK (extracellular signal regulated kinase) yanıtları bakımından fonksiyonel seçiciliği değerlendirilmiştir. Çalışma sonunda şu sonuçlar elde edilmiştir: 1) Çalışmada test edilen ligandların iki yanıtı uyarma efikasileri genel olarak korele olduğu halde, 4 agonist (prokaterol, simaterol, klenbuterol, terbutalin) cAMP yanıtını yüksek efikasi ile uyarmalarına rağmen ERK yanıtını uyaramamaktadır. 2) Bu ligandların fonksiyonel seçiciliği hücre kültürü koşullarına bağlıdır. Hücre-hücre kontaktı tedrici olarak azaltıldıkça cAMP'nin ERK'i aktive etme yeteneği kazanmasına bağlı olarak bu 4 ligandın fonksiyonel seçiciliği ortadan kalkmaktadır. 3) cAMP'nin ERK'i aktive edemediği koşullarda ERK'i aktive edebilen katekolik ß2-AR ligandları (izoproterenol, adrenalin, dobutamin) ile uyarılan ERK yanıtının pertussis toksine duyarlı olması bu yanıtın Gi/o aracılı olduğunu düşündürmektedir.Çalışmanın bundan sonraki aşamasında cAMP-ERK ve Gi/o-ERK sinyal yolları bileşenlerinin incelenmesi hedeflenmiştir. Literatür bilgisine göre bu yollara aracılık etme potansiyeli bulunan proteinler B-Raf, C-Raf, Ras ve Rap'dır. Bu çalışmada, bu proteinlerin ve ERK'in aktivasyonunu değerlendirebilmek için, intramoleküler FRET (Floresan Rezonans Enerji Transferi) prensibi ile çalışan Prin-C-Raf, Prin-B-Raf, Raichu-Rap, Raichu-Ras ve Miu2-ERK konstraktlarının, uygun araçlar olup olmadıkları incelenmişfunduszeue.info iki florofor arasındaki enerji transferini tanımlayan bir terimdir. Bu mekanizmada bir donör florofor tarafından yayılması beklenen ışık daha yayılmadan akseptör florofor tarafından ?emilmekte? (yani resonant enerji transferi olmakta) ve akseptör florofor kendi emisyon spekturumunda ışıma yapmaktadır. İki florofor arasında FRET'in gerçekleşebilmesi için florofor çifti arasındaki uzaklığın enerji transferine olanak sağlayacak ölçüde küçük (<10 nm) olması ve donör floroforun emisyon spektrumuyla akseptör floroforun absorbsiyon spekturumunun örtüşmesi gerekmektedir. İntramoleküler FRET yönteminde, rekombinan teknikler aracılığıyla donör florofor-hedef protein- akseptör florofor füzyon proteinleri tasarlanmaktadır. Hücrelere heterolog olarak eksprese ettirilen füzyon proteininin iki ucuna bağlı donör ve akseptör floroforun birbirine yaklaşması durumunda FRET'in gerçekleşmesi beklenmektedir. Böylece bu yöntem protein konformasyonundaki değişimleri monitörize etmeye olanak sağlamaktadır. Bu çalışmada test edilen FRET konstraktlarında FRET sinyali, proteinlerin aktivasyonuna duyarlıdır. Çalışma sonunda Miu2-ERK dışındaki FRET konstraktlarının hücre sistemimizde cAMP-ERK ve Gi/o-ERK yolunu incelemek için uygun araçlar olmadığı anlaşılmıştır. Ancak FRET yönteminde, deney veya analiz aşamasında artefakta neden olabilecek faktörlerin incelenmesi bakımından çalışma verileri öğretici bilgiler sunmuştur. AbstractG-protein coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of cell surface receptors that transmit extracellular signals to intracellular milieu. The fact that more than 50 % of current therapeutics target the GPCRs, and that these proteins have still been considered as potential targets for new drugs, keeps the interest still alive towards GPCR-mediated signalling. Recent findings about GPCR-mediated signalling in the last decade gave rise to the recognition of new phenomena that have never been considered in the classical view of receptor action. One such phenomena is the so called ?Functional selectivity of ligands?, which refers to the fact that the receptor ligands are able to activate multiple signalling pathways (coupled to the same receptor) differentially. In other words, ligands may possess differential efficacies towards divergent signalling pathways that start from the same funduszeue.info the present study, we investigated functional selectivity of ß2-AR ligands in terms of their ability to stimulate cAMP and ERK (extracellular signal regulated kinase) responses through ß2-AR, which has long been considered as a prototypical member of the GPCR family. We used HEK cells expressing ß2-AR heterologously as a model system. We made the following observations: 1) Although the efficacy of the tested ligands in stimulating cAMP and ERK responses were generally well correlated, four agonists, namely, terbutaline, clenbuterol, cimaterol and procaterol, were unable to stimulate ERK response despite their high efficacy in activating cAMP response. 2) Functional selectivity observed with the latter four ligands depended on the confluence state of the cell culture, and it gradually fade away as the confluence went down. Then, it turned out that the confluence of the cell culture (or cell-to-cell contact) actually determines the ability of cAMP to stimulate ERK phosphorylation: cAMP gained the ability to stimulate ERK response as the confluence of the culture decreased, which explains why the otherwise selective ligands lost their functional selectivities in non-confluent cells. 3) ERK responses to catecholamines (namely adrenalin, isoproterenol and dobutamine) that were able to activate ERK in conditions where cAMP could not, were sensitive to pertussis toxin treatment, suggesting the involvement of Gi/o in this funduszeue.info the next phase of the study, we investigated the components of cAMP-ERK and Gi/o-ERK signalling pathways. It has been reported that B-Raf, C-Raf, Ras and Rap should be the fundamental proteins that mediate the signals in the ERK activation pathway. Therefore, we ask whether or not the FRET probes that are supposed to monitor the activity state of these proteins in living cells could be used to investigate the cAMP-ERK or Gi/o-ERK pathway. We used the following intramolecular FRET constructs: Prin-C-Raf, Prin-B-Raf, Raichu-Rap, Raichu-Ras and Miu2-ERK. The constructs were expressed heterologously in HEK funduszeue.info term FRET refers to Flourescence Resonance Energy Transfer, a phenomenon where the light that should be emitted from a donor fluorophore is ?absorbed? before it is emmited, by an acceptor fluorophore, which then emits light having a wave length within the emission spectrum of the acceptor. In order for such an energy transfer to occure, the distance between the donnor and acceptor fluorophores should not be large (typically <10 nm), and there must be a certain overlap between the emission spectrum of the donor and the absorption spectrum of the acceptor. In the case of intramolecular FRET, the donor and the acceptor is fused to the same protein molecule to monitor conformational changes in the protein; as the distance between the donnor and acceptor changes due to the conformatinal fluctuations in the host molecule, the FRET signal follows the changes accordingly. Thus, the method constitutes a nice tool to monitor time-dependent conformational changes in proteins. The constracts mentioned above have been designed in such a way that the FRET signal is sensitive to the activation of the proteins. However, we eventually found that these constracts, except Miu2-ERK, were not suitable tools to investigate cAMP-ERK and Gi/o-ERK signalling pathways in our cell system for reasons explained in the text. Nevertheles, the study provided valuable information concerning possible sources of artefacts in such experiments.